Impact of Nitrogen Nutrition and Ectomycorrhizal Interaction on Populus x canescens Xylem Sap Composition and Defense

by Karl Kasper
Doctoral thesis
Date of Examination:2020-09-04
Date of issue:2020-10-15
Advisor:Prof. Dr. Andrea Polle
Referee:Prof. Dr. Andrea Polle
Referee:Prof. Dr. Ivo Feussner
Referee:Prof. Dr. Gerhard Braus
Referee:PD Dr. Till Ischebeck
Referee:PD Dr. Marcel Wiermer
Persistent Address: http://dx.doi.org/10.53846/goediss-8259

 

 

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Abstract

English

Nitrogen (N) is an essential macro-nutrient for plant growth and development. Inorganic N is taken up by plant roots as ammonium (NH4+) or nitrate (NO3-). Roots of tree species are colonized by mycorrhizal fungi, which promote plant N supply. Once taken up, nitrogen is transported from the roots to the shoots via the xylem sap. The availability of N as well as the mutualistic interaction with mycorrhizal fungi can influence plant resistance towards pests and pathogens. It is unknown, if the availability of nitrate or ammonium in the nutrient solution affect the composition of the xylem sap, resulting different defense reactions in leaves. It is further unknown, if mycorrhizal interactions recruit nutrient signals to affect the defense of leaves. The main goal of this work was to analyze the influence of N availability and mycorrhizal interaction on the xylem sap composition of a tree species in a multi-omics approach. For this purpose, two experimental approaches were chosen: Populus x canescens plants were cultivated (a) with different concentrations of NH4+ or NO3- and (b) with or without interaction with ectomycorrhizal fungus (EMF) Laccaria bicolor. To comprehensively study the xylem sap composition, we used targeted and non-targeted metabolome analyses, proteome analyses with a label-free quantification approach, and spectrophotometric tests for nitrate, ammonium and protein analysis. We studied the leaf transcriptome by RNA sequencing to get insights into systemic plant responses to the treatments. To investigate plant resistance towards pathogens, we developed bioassays for a leaf and a vascular pathogen employing the necrotrophic fungus Marssonina castagnei and the biotrophic bacterium Brennaria salicis. We addressed the following questions: i) How does the availability of different N forms and concentrations or ectomycorrhizal symbiosis influence the xylem sap composition? ii) Are systemic defense responses induced by varying N supply or interaction with EMF? iii) Do different N availabilities and ectomycorrhizal interaction influence resistance of leaves towards M. castagnei and attenuate growth B. salicis in xylem sap. i) P. x canescens xylem sap proteome and metabolome were severely influenced by different N availabilities. Increasing N concentrations led to accumulation of xylem sap proteins, while not altering the xylem sap proteome functionality. The abundance of secondary metabolites in xylem sap decreased while primary metabolites increased with increasing N availability. The effect of ectomycorrhizal symbiosis was less intense but revealed differentially accumulated proteins and metabolites, known to be involved in long-distance stress signaling. Functional analyses of these candidate compounds are required in the future. ii) Nitrogen concentrations and forms influenced the leaf transcriptomes. Low NO3- treatment mainly induced responses following the salicylic acid (SA) signaling pathway while high N treatments induced jasmonic acid (JA)-dependent responses. Axenic co-cultivation of poplar with L. bicolor induced transcriptional responses of genes assigned to SA-, JA- and JA/Ethylene(ETH)-dependent defense signaling, preparing the plant for the attack by herbivores or microbial pathogens. iii) We successfully established a test system adapted to investigate bacterial growth in very low amounts of sample since xylem sap availability is a limiting factor. We found that high ammonium nutrition significantly enhanced bacterial growth in xylem sap compared with xylem sap of nitrate-fed poplar plants. The influence of ectomycorrhizal interaction on bacterial growth in xylem sap was low. We further established a detached leaf assay to test P. x canescens resistance towards a necrotrophic pathogen, filling a gap in poplar research. Preliminary results suggest that nitrogen availability has a low or no effect on disease severity caused by M. castagnei. In conclusion, the presented work generated the most comprehensive xylem sap analysis in a tree species and provides novel information on the flexibility of xylem sap composition in response to changes in N nutrition and ectomycorrhizal symbiosis. The results give valuable insights in xylem sap functionality and adaptation to environmental changes. Leaf transcriptome data revealed systemic induction of poplar defense responses by nutrition and mycorrhizal treatments. The development of two P. x canescens pathogen test systems are valuable tools for future research and can be used for poplar breeding programs.
Keywords: Poplar; Ectomycorrhiza; Xylem sap; Defense; Populus; transcriptome; metabolome; proteome

German

Stickstoff (N) ist ein essentieller Makronährstoff für das Pflanzenwachstum. Stickstoff wird in inorganischer Form von Pflanzenwurzeln als Ammonium (NH4+) oder Nitrat (NO3-) aufgenommen. Baumwurzeln sind von Mykorrhizapilzen kolonisiert, welche die pflanzliche Stickstoffaufnahme fördern. Nach der Aufnahme wird Stickstoff im Xylemsaft von den Wurzeln zum Schoss transportiert. Die Verfügbarkeit von Stickstoff und die Interaktion mit Mykorrhizapilzen kann die pflanzliche Resistenz gegen Schädlinge und Krankheiten beeinflussen. Es ist nicht bekannt of die Verfügbarkeit von Nitrat oder Ammonium in der Nährstofflösung die Zusammensetzung des Xylemsaftes beeinflusst und dadurch veränderte Abwehrreaktionen in den Blättern auslöst. Es ist auch nicht bekannt ob Mykorrhizainteraktionen Nährstoffsignale rekrutieren um damit die Abwehrmechanismen von Blättern zu beeinflussen. Das Hauptziel dieser Arbeit war es den Einfluss von Stickstoffverfügbarkeit und Mykorrhizainteraktion auf die Xylemsaftzusammen-setzung in einem multi-omics Verfahren zu analysieren. Dafür wurden zwei experimentelle Ansätze gewählt: Populus x canescens Pflanze wurden (a) unter verschiedenen Konzentrationen von NH4+ und NO3- und (b) mit und ohne Interaktion mit dem ektomykorrhizapilz Laccaria bicolor kultiviert. Um die Xylemsaftzusamensetzung umfassend zu untersuchen wurden gerichtete und ungerichtete Metabolomanalysen, Proteomanalysen mit einer Label-freien Quantifizierung und Spektrophotometrische Tests zur Analyse von Nitrat, Ammonium und Proteinen genutzt. Per RNA Sequenzierung haben wir das Blatttranskriptom untersucht um Informationen zur Auswirkung der experimentellen Behandlungen auf systemische Pflanzenreaktionen zu erhalten. Um die Pflanzenresistenz gegen Krankheiten zu untersuchen haben wir Testsysteme für ein Blatt- und ein Vaskulaturpathogen entwickelt, in denen wir den nekrotrophen Pilz Marssonina castagnei und das biotrophe Bakterium Brennaria salicis genutzt haben. Wir haben die folgenden Fragen adressiert: i) Wie wirkt sich die Verfügbarkeit von unterschiedlichen Stickstoffformen und -konzentrationen oder Ektomykorrhiza auf die Zusammensetzung des Xylemsaftes aus? ii) Werden systemische Abwehrreaktionen durch die Behandlungen induziert? iii) Wirken sich verschiedene Stickstoff Verfügbarkeiten und Ektomykorrhiza auf die Resistenz gegen M. castagnei aus und verringern sie das Wachstum von B. salicis im Xylemsaft? i) Das P. x canescens Xylemsaft Proteom und Metabolom wurden stark durch unterschiedliche Stickstoffverfügbarkeiten beeinflusst. Erhöhte Stickstoffkonzentrationen haben zur Anreicherung von Xylemsaft Proteinen geführt, während sich an der Funktionalität des Proteoms nichts geändert hat. The Häufigkeit von Xylemsaft Sekundärmetaboliten hat abgenommen, während Primärmetabolite mit erhöhter Stickstoffverfügbarkeit zugenommen haben. Der Effekt der Ektomykorrhiza war weniger intensiv, bestimmte Proteine und Metabolite mit bekannten Funktionen in Langstreckensignalübertragung zur Induktion von Abwehrmechanismen. Die funktionelle Überprüfung dieser Signalstoff-Kandidaten sollte Gegenstand zukünftiger Forschungsarbeiten sein. ii) Stickstoffkonzentration und -form haben das Blatttranskriptom beeinflusst. Die Behandlung mit niedrigen Nitratkonzentrationen hat Reaktionen hervorgerufen die dem Salicylsäure(SA)-Signalweg folgen, während die Zugabe von hohen Stickstoffkonzentrationen Jasmonsäure (JA)-abhängige Reaktionen Induziert hat. Axensiche Ko-Kultivierung von Pappel und L. bicolor hat Transkriptionsänderungen verursacht, die den SA-, JA-, und JA/Ethylen(ETH)-abhängigen Signalwegen folgen und damit die Pflanze auf den Befall von Herbivoren und verschiedenen Krankheiten vorbereitet. iii) Wir haben erfolgreich ein Testsystem angepasst um bakterielles Wachstum in sehr geringen Mengen von Xylemsaft untersuchen zu können, weil die Probenmenge ein limitierender Faktor ist. Wir haben herausgefunden, dass hohe Ammoniumversorgung das Bakterienwachstum im Xylemsaft signifikant erhöht hat im Vergleich mit Xylemsaft von Nitrat-versorgten Pappeln. Der Einfluss der Ektomykorrhiza auf das bakterielle Wachstum war gering. Wir haben des Weiteren ein Testsystem entwickelt mit dem sich die Resistenz von P. x canescens gegenüber einem nekrotrophen Pilz testen lässt, dies füllt eine Lücke in der Pappelforschung. Erste Resultate deuten an, dass die Stickstoffversorgung entweder nur einen geringen oder keinen Einfluss auf Schwere einer M. castagnei-Infektion hat. Zusammengefasst haben wir in der vorliegenden Arbeit die umfangreichste Xylemsaftanalyse einer Baumspezies generiert und präsentieren neue Informationen über die Flexibilität der Xylemsaftzusammensetzung in Reaktion zu veränderter Stickstoffversorgung und Ektomykorrhiza. Diese Ergebnisse geben wertvolle Einblicke in Xylemsaftfunktion und -adaption and wechselnde Umweltbedingungen. Die Blatttranskriptomedaten haben eine systemische Induktion von Pappelabwehr durch Ernährung und Mykorrhiza gezeigt. The Entwicklung von zwei P. x canescens Pathogen-Testsystem sind nützliche Methoden für zukünftige Forschungen und können in Pappel-Zuchtprogrammen genutzt werden.
 
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