Der direkte und indirekte Effekt von Zytokinen bei Morbus-Crohn-Patienten auf die Differenzierung von Osteoklasten - Effekt unter besonderer Berücksichtigung von TNF-α, Interleukin-1ß und Interleukin-6 -

The direct and indirect effect of cytokines in Crohn's disease patients on osteoclast differentiation - Effect with special consideration of TNF-α, interleukin-1ß and interleukin-6 -

by Enver Aydilek
Doctoral thesis
Date of Examination:2020-10-28
Date of issue:2020-10-20
Advisor:Prof. Dr. Heide Siggelkow
Referee:Prof. Dr. Nicolai Miosge
Referee:Prof. Dr. Margarete Schön
Persistent Address: http://dx.doi.org/10.53846/goediss-8265

 

 

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Abstract

English

Crohn's disease is associated with an increased prevalence of osteoporosis and fractures whose pathogenesis is still controversial. However, among the most important influences, the disease activity, in particular the increase in the concentration of cytokine combination (IL-1, IL-6 and TNF-alpha) is in focus. In this PhD thesis the direct and indirect effect of this cytokine combination, as measured in Crohn's disease patients, on osteoclast differentiation and activity was investigated. At the same time, the optimal conditions for the cultivation of osteoclasts from monocytes were determined by different experimental approaches. Monocytes were isolated from donated buffy coats using a special magnet separation method from MACS Technology. Stimulation in the direction of osteoclasts was performed by adding RANKL 100ng/ml and M-CSF 25ng/ml in a time frame of 14 to 21 days. The concentration and time of addition of the respective cytokines and cytokine combinations was varied in several experiments. In addition to the cytokine combination, supernatants of osteoblasts, which were previously treated with the cytokine combination (IL-1, IL-6 and TNF-alpha) for 48 hours, were added. Real-time PCR was used for quantitative gene analysis and staining with toludine blue and TRAP for qualitative analysis. Activity measurement of osteoclasts was performed on a matrix prepared using SAOS-2 cells and the CSR-BRA-24 Resorption Assay Kit 24. Immunostaining was performed using antibodies for VNRT and protein level analysis using Western Blot for Cathepsin K and Vitronectin. Statistical evaluation was performed using ANOVA analysis of variance within the GraphPad Prism program. Gene expression of specific osteoclast proteins such as VNRT, Cathepsin K, TRAP and MMP 9 was used to demonstrate successful cultivation and differentiation of osteoclasts. With the addition of the cytokine combination (IL-1, IL-6 and TNF-alpha) we could show a direct inhibitory effect on osteoclast activation. After addition of the cytokine-treated osteoblasts' supernatants to the osteoclasts, an increase in the osteoclast surface markers was observed. Correspondingly, a significantly increased rate of resorption was found when using the supernatants in the resorption analysis. In this study, a direct and indirect effect of the cytokine combination of IL-1, IL-6 and TNF-alpha could be shown. The decrease in gene expression of osteoclast markers with increasing resorption activity could be due to the shift of RANKL/OPG in favor of RANKL. However, other, as yet unknown factors may also be involved, which only show an influence at the protein level. The reduction of gene expression could be explained by the high activity of osteoclasts during resorption. The treatment of osteoclasts with the supernatants from osteoblasts treated with the cytokine combination showed a significant increase of this effect. Further investigations and experimental approaches, especially with the optimal experimental conditions determined in this work, should provide information on this.
Keywords: Crohn's disease; fracture; osteoporosis; IL-1, IL-6, TNF-alpha; osteoclast; osteoblast

German

Die Erkrankung Morbus Crohn ist assoziiert mit einer erhöhten Prävalenz einer Osteoporose sowie Frakturen, dessen Pathogenese noch umstritten ist. Unter den wichtigsten Einflüssen steht jedoch die Krankheitsaktivität, insbesondere der Konzentrationsanstieg der Zytokinkombination (IL-1, IL-6 und TNF-alpha) im Focus. In dieser Doktorarbeit wurde die direkte und indirekte Wirkung dieser Zytokinkombination, wie sie in Morbus-Crohn-Patienten gemessen wurde, auf die Differenzierung der Osteoklasten sowie ihre Aktivität untersucht. Gleichzeitig wurden die optimalen Bedingungen für die Kultivierung der Osteoklasten aus Monozyten durch verschiedene Versuchsansätze ermittelt. Aus gespendeten buffy coats erfolgte die Isolation von Monozyten mittels spezieller Magnet Separationsmethode der MACS Technology. Mittels Zugabe von RANKL 100ng/ml und M-CSF 25ng/ml in einem Zeitrahmen von 14 bis 21 Tagen erfolgte die Stimulation in Richtung Osteoklasten. In mehreren Versuchsansätzen erfolgte eine Variation der Konzentration und des Zugabezeitpunktes der jeweiligen Zytokine und Zytokinkombinationen. Neben der Zytokinkombination wurden außerdem Überstände von Osteoblasten, welche zuvor 48 Stunden mit der Zytokinkombination (IL-1, IL-6 und TNF-alpha) behandelt wurden, hinzugefügt. Für die quantitative Genanalyse wurde Realtime-PCR und für die qualitative Analyse Färbungen mittels Toludinblau und TRAP eingesetzt. Die Aktivitätsmessung der Osteoklasten erfolgte auf einer Matrix, die mit Hilfe von SAOS-2-Zellen hergestellt wurde, sowie dem Resorptionsassay-Kit 24 von CSR-BRA-24. Eine Immunfärbung erfolgte mittels Antikörper für VNRT und Analysen auf Proteinebene mittels Western Blot für Cathepsin K und Vitronektin. Zu der statistischen Auswertung diente die Varianzanalyse ANOVA innerhalb des Programms GraphPad Prism. Anhand der Genexpression der spezifischen Osteoklastenproteine wie VNRT, Cathepsin K, TRAP und MMP 9 wurde eine erfolgreiche Kultivierung und Differenzierung von Osteoklasten dargestellt. Unter der Zugabe der Zytokinkombination (IL-1, IL-6 und TNF-alpha) konnten wir eine direkte hemmende Wirkung auf die Osteoklastenaktivierung zeigen. Nach Zugabe der Überstände der zytokinbehandelten Osteoblasten auf die Osteoklasten zeigte sich eine Erhöhung der Oberflächenmarker der Osteoklasten. Übereinstimmend konnte eine signifikant erhöhte Rate der Resorption bei Verwendung der Überstände in der Resorptionsanalyse nachgewiesen werden. In dieser Arbeit konnte somit ein direkter sowie indirekter Effekt der Zytokinkombination von IL-1, IL-6 und TNF-alpha, dargestellt werden. Die Abnahme der Genexpression der Osteoklastenmarker bei ansteigender Resorptionsaktivität könnte durch die Verschiebung des RANKL/OPG zugunsten des RANKL bedingt sein. Aber es kommen auch andere, noch nicht bekannte Faktoren in Frage, die nur auf Proteinebene einen Einfluss zeigen. Die Reduzierung der Genexpression wäre u. a. auch durch den großen Aktivitätsaufwand der Osteoklasten im Rahmen der Resorption erklärbar. Durch die Behandlung der Osteoklasten mit den Überständen aus Osteoblasten, welche mit der Zytokinkombination behandelt wurden, zeigte sich eine deutliche Verstärkung dieser Wirkung. Weitere Untersuchungen und experimentelle Versuchsansätze, vor allem mit den in dieser Arbeit ermittelten optimalen Versuchsbedingungen, sollten hierüber Aufschluss geben.
 
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