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SNARE-mediated membrane fusion on pore-spanning membranes – several fusion pathways analyzed by single-vesicle content release

dc.contributor.advisorSteinem, Claudia Prof. Dr.
dc.contributor.authorMühlenbrock, Peter
dc.date.accessioned2021-01-08T12:23:14Z
dc.date.available2021-01-08T12:23:14Z
dc.date.issued2021-01-08
dc.identifier.urihttp://hdl.handle.net/21.11130/00-1735-0000-0005-153D-0
dc.identifier.urihttp://dx.doi.org/10.53846/goediss-8395
dc.language.isoengde
dc.rights.urihttp://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/
dc.subject.ddc572de
dc.titleSNARE-mediated membrane fusion on pore-spanning membranes – several fusion pathways analyzed by single-vesicle content releasede
dc.typedoctoralThesisde
dc.contributor.refereeSteinem, Claudia Prof. Dr.
dc.date.examination2020-12-18
dc.description.abstractgerDie Fusion von Neurotransmitter gefüllten Vesikeln mit der präsynaptischen Membran ist der Schlüsselschritt in der neuronalen Signaltransduktion und wird durch SNARE- (soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment receptor) Proteine vermittelt. Die Interaktion der drei SNARE-Proteine Synaptobrevin 2, Syntaxin 1A und SNAP25 (synaptosomal associated protein of 25 kDa) überwindet die Energiebarriere der Verschmelzung beider Lipid Doppelschichten, was zum Transfer von Neurotransmittern über die präsynaptische Membran und in den synaptischen Spalt führt. Um diesen essenziellen Schritt zu untersuchen, wurden in dieser Arbeit porenüberspannende Membranen (PSMs) als Modellsystem der präsynaptischen Membran genutzt. PSMs sind Lipiddoppelschichten, die aus festkörperunterstützten (s-PSM) und porenüberspannenden, freitragenden Bereichen (f-PSM) bestehen. Durch Letztere sind sie geeignet, den Transferprozess von wasserlöslichen Fluorophoren durch eine Fusionspore aus dem Inneren von hinzugegebenen Vesikeln über die PSM mittels Fluoreszenzmikroskopie zu beobachten. Durch die gleichzeitige Detektion der Lipiddiffusion von der PSM in den Vesikel wurden verschiedene Fusionswege quantifiziert. Die Oberfläche von porösen Substraten mit Porendurchmessern von 1.2 m oder 3.5 m wurde hydrophilisiert, indem eine selbstorganisierte Monoschicht aus 6-Mercapto-1-hexanol auf Gold gebildet wurde. PSMs wurden dann durch das Spreiten von target-SNARE enthaltenden riesigen unilamellaren Vesikeln erzeugt. Unterschiede in der Konzentration der t-SNAREs in PSMs waren als Schwankungen der Dockingeffizienz von syb 2 enthaltenden Liposomen an die PSMs sichtbar. Anschließend wurde die Ausbildung einer Fusionspore durch den Ausstrom von Sulforhodamin B (SRB) vom Vesikelinnern in die Kompartimente unterhalb der f-PSM beobachtet. Dieser Prozess geschah quasi simultan mit der Lipidvermischung der beiden Membranen und führte bevorzugt zu einer vollständigen Ausschüttung des Vesikelinhalts. Zudem war dieser Hauptfusionsweg wahrscheinlicher für kleinere Vesikel und endete in einem raschen, vollständigen Kollaps des fusionierten Vesikels in die PSM und zeigt somit charakteristische Eigenschaften der full-collapse Fusion, welche in vivo beobachtbar ist. Abgesehen davon konnte das vorzeitige Schließen der Fusionspore zu einem unvollständigen Ausstrom von SRB und einer stabilen, dreidimensionalen Postfusionsstruktur führen. Aus diesem Zustand konnte der Vesikel erneut fusionieren, was zum komplexen Fusionsweg einer flackernden Fusionspore führte. Die Komplexität des Fusionsprozesses, wie er in vivo beobachtet wird, scheint somit nicht durch die Vielzahl an Proteinen, sondern bereits durch die minimale Fusionsmaschinerie herbeigeführt zu werden.de
dc.description.abstractengThe fusion of neurotransmitter filled vesicles with the presynaptic membrane is the key step in the neuronal signaling cascade and is mediated by soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment receptor proteins (SNAREs). The interaction of the three SNARE proteins synaptobrevin 2 (syb 2), syntaxin 1A, and SNAP25 (synaptosomal associated protein of 25 kDa) is pivotal to overcome the energy barrier that leads to merging of the opposing lipid bilayers and results in the transfer of neurotransmitters across the presynaptic membrane and into the synaptic cleft. To investigate this fundamental process, pore-spanning membranes (PSMs) were utilized in this work as a model system of the presynaptic membrane. PSMs are continuous lipid bilayers with solid supported parts (s-PSM) as well as freestanding membranes spanning large aqueous compartments (f-PSM). Thus they are suitable to monitor the process of content transfer through a fusion pore of added vesicles filled with a water soluble dye by means of fluorescence microscopy. Simultaneous imaging of lipid dye diffusion from the PSM into the vesicular membrane via a fusion stalk was used to quantify different fusion pathways. The surface of porous substrates with pore diameters of 1.2 m or 3.5 m was hydrophilized with a self-assembled monolayer of 6-mercapto-1-hexanol formed on gold and PSMs were then produced by spreading of acceptor complex containing giant unilamellar vesicles. Differences in densities of target SNAREs inside PSMs were noticeable in variations of docking efficiencies of syb 2 containing, sulforhodamine B (SRB) filled liposomes to the PSMs. The fusion pore formation was then directly visualized by imaging the transfer of SRB from inside the vesicle into the space underneath the f-PSM. This process proved to be very rapid and distinguishable from rarely occurring burst events. Furthermore, it mainly occurred simultaneously with lipid diffusion from the PSM into the vesicular membrane and resulted predominantly in a full release of vesicular content. Additionally, this main fusion pathway was more likely for smaller vesicles and included a rapid and full collapse of the fusing vesicle into the PSM and thus shows distinct features of full-collapse fusion observed in vivo. Apart from this, the premature closing of the fusion pore could lead to a stable three-dimensional postfusion structure that was often times accompanied by a partial SRB release. From this state the fusion pore could open again leading to the complex fusion behavior of a flickering fusion pore. In summary, the results of this study show that the diverse fusion pathways observed in vivo likely are an intrinsic property of the minimal fusion machinery and not caused by the interplay of additional proteins.de
dc.contributor.coRefereeSalditt, Tim Prof. Dr.
dc.subject.engSNAREsde
dc.subject.engfusionde
dc.subject.engsingle-vesiclede
dc.subject.engfusion pathwaysde
dc.subject.engcontent releasede
dc.identifier.urnurn:nbn:de:gbv:7-21.11130/00-1735-0000-0005-153D-0-7
dc.affiliation.instituteGöttinger Graduiertenschule für Neurowissenschaften, Biophysik und molekulare Biowissenschaften (GGNB)de
dc.subject.gokfullBiologie (PPN619462639)de
dc.identifier.ppn1744275556


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