Präklinische Analyse von epithelialen und stromalen Markern in einem transgenen Mausmodell für Pankreaskarzinome
Preclinical analysis of epithelial and stromal markers in a transgenic mouse model for pancreatic cancer
by Lukas Klein
Date of Examination:2021-01-12
Date of issue:2021-01-12
Advisor:Dr. Albrecht Prof Neeße
Referee:Dr. Albrecht Prof Neeße
Referee:Prof. Dr. Philipp Ströbel
Persistent Address:
http://dx.doi.org/10.53846/goediss-8402
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Name:Doktorarbeit Lukas Klein 23.04.2020 Druckversion.pdf
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Abstract
English
Pancreatic ductal adenocarcinoma is amongst the most aggressive cancers and is associated with an extremely poor prognosis. From a histological perspective, pancreatic cancer is char-acterised by a distinct, widespread stromal reaction, involving activated, tumor-associated fibroblasts and immune cells as well as secreted proteins like SPARC, hyaluronic acid and collagen. The entire tumor-associated stroma is denominated as the tumor microenviron-ment. The role of the tumor stroma is complex and still not fully understood. Many compo-nents of the tumor stroma are associated with increased aggressiveness, immune evasion, chemoresistance and reduced survival. On the other hand, though, the extensive experimental ablation of fibroblasts and other stromal components has led to more aggressive tumors and reduced survival in mouse models. In 2005 Hingorani et al. developed a genetically engineered mouse model (KPC, LSL-KrasG12D/+;LSL-Trp53R172H/+;Pdx-1-Cre), in which the tumor stroma closely mimics that ob-served in human pancreatic cancers. These mice gain mutations in KRAS and Trp53 under the activation of Cre and thus develop, as far as is currently possible, specific pancreatic adeno-carcinomas. The aim of this thesis is to further characterize epithelial and stromal markers in the KPC mouse model and to evaluate if there is a correlation between those markers and the overall survival of the mice. Therefore, pancreatic adenocarcinomas of 46 KPC mice were stained and analyzed using immunohistochemistry and immunofluorescence techniques, fo-cusing on the following parameters: proliferation rate, mitotic rate, apoptotic rate, fibroblast proliferation rate, content of collagen, SPARC, hyaluronic acid and α-smooth muscle actin, as well as blood vessel density, mean lumen area, grading, desmoplasia and the activated stroma index. A univariate analysis using the Kaplan-Meier estimator did not show a correlation between survival of the KPC mice and any of the analyzed parameters. However, multivariate analysis using a Cox proportional hazards regression did find an association between higher prolifera-tion rates (Ki67) and prolonged survival, while higher fibroblast proliferation rate (α-SMA+Ki67) and mitotic rate (PHH3) were associated with reduced survival. However, the results from the statistical analysis are likely biased by collinearity. These observations in mouse differ from some of the data obtained analysing human tissue. However, some other studies support the findings of this thesis. This fact further emphasizes the complexity of the tumor microenvironment in human and murine pancreatic cancer. In addition, this thesis also investigated whether and to what extent the tumor stroma in pri-mary pancreatic cancers differs from the stroma in corresponding liver metastases. To ad-dress this question, we used immunohistochemistry and western blotting analysis to compare primary tumors and their corresponding liver metastases in KPC mice. In immunohistochem-ical analysis, liver metastases appeared to have lower contents of collagen and α-smooth mus-cle actin but contained higher levels of hyaluronic acid than the primary tumors. Using im-munohistochemical analysis, we could not detect any difference regarding the levels of SPARC, vessel density, proliferation rate or apoptotic rate. Western blotting analysis of whole tumor tissue showed higher concentrations of SPARC, α-smooth muscle actin and fibron-ectin in liver metastases than in the primary tumors. These results led us to conclude that liver metastases are containing less stroma than primary tumors. Nonetheless both tumor com-partments are highly desmoplastic. This thesis contributes to the further characterization of the tumor stroma of pancreatic ade-nocarcinomas in the KPC mouse model and provides data on the impact of components of the tumor microenvironment on the overall survival.
Keywords: PDAC; pancreatic cancer; KPC mouse model
German
Das duktale Pankreaskarzinom ist eine der aggressivsten Krebserkrankungen und geht mit einer ausgesprochen schlechten Prognose einher. Histologisch dominiert eine stark desmo-plastische Stromareaktion, bestehend aus aktivierten tumorassoziierten Fibroblasten und Im-munzellen sowie sezernierten Proteinen wie SPARC, Hyaluronsäure und Kollagen, das Bild des Pankreaskarzinoms. Die Gesamtheit des tumorassoziierten Stromas wird als Tumormik-romilieu bezeichnet. Die Rolle des Stromas ist divers und unzureichend verstanden. So wer-den viele Komponenten des Stromas mit höherer Aggressivität, Immunevasion, Chemoresis-tenz und verkürztem Überleben assoziiert, gleichzeitig führte die weitestgehende Ablation von Fibroblasten und Stroma im Mausmodell zu noch aggressiveren Tumoren und verkürztem Überleben. Seit 2005 existiert ein von Hingorani et al. entwickeltes transgenes Mausmodell (KPC, LSL-KrasG12D/+;LSL-Trp53R172H/+;Pdx-1-Cre), welches das Tumorstroma, wie es in humanen Kar-zinomen beobachtet wird, rekapituliert. Die Mäuse entwickeln Cre-vermittelt unter Kontrolle von Mutationen in KRAS und Trp53 weitestgehend pankreasspezifisch Adenokarzinome. Ziel der Arbeit war es in diesem Mausmodell epitheliale und stromale Marker weiter zu charakteri-sieren und zu eruieren, ob für bestimmte epitheliale und stromale Komponenten ein Zusam-menhang zum Überleben der Mäuse beobachtet werden kann. Dafür wurde das Stroma von Pankreaskarzinomen aus 46 KPC-Mäusen mittels Immunhistochemie und Immunfluoreszenz auf folgende Aspekte untersucht: Proliferationsrate, Mitoserate, Apoptoserate, Fibroblasten-proliferationsrate, Gehalt von Kollagen, SPARC, Hyaluronsäure und α-smooth muscle actin sowie Gefäßdichte, mittlere Gefäßfläche, Grading, Desmoplasie und den aktivierten Stromaindex. In einer univariaten Analyse mittels Kaplan-Meier-Kurve konnte für keinen Parameter ein Zusammenhang zur Überlebensdauer der KPC-Mäuse gefunden werden. Eine multivariate Cox-Regression hingegen zeigte, dass eine höhere Proliferationsrate (Ki67) mit längerem Überleben assoziiert war, während eine hohe Fibroblastenproliferationsrate (α-SMA+Ki67) und Mitoserate (PHH3) mit kürzerem Überleben einhergingen. Diese Beobachtungen stehen im Kontrast zu einigen Ergebnissen aus humanen Geweben, werden jedoch auch von anderen Studien gestützt. Einschränkend muss hier auf Schwächen der statistischen Analyse hinsicht-lich Kollinarität hingewiesen werden. Diese Tatsache unterstreicht die Komplexität des Tu-mormikromilieus im humanen und murinen Pankreaskarzinom. Eine weitere Fragestellung dieser Arbeit war, ob und inwiefern sich das Tumorstroma in pri-mären Pankreastumoren und korrespondierenden Lebermetastasen unterscheidet. Hierfür wurden Primärtumoren und korrespondierende Lebermetastasen von KPC-Mäusen mittels Immunhistochemie und Westernblot verglichen. In der Immunhistochemie zeigten sich Le-bermetastasen ärmer an Kollagen und α-smooth muscle actin, enthielten jedoch mehr Hyaluron-säure als die Primärtumoren. Bezüglich SPARC-Gehalt und Gefäßdichte sowie Proliferati-ons- und Apoptoserate konnte kein Unterschied zwischen beiden Kompartimenten gefunden werden. Der Westernblot aus Tumorlysaten zeigte für SPARC, α-smooth muscle actin und Fib-ronektin niedrigere Konzentrationen in Lebermetastasen als in Primärtumorgewebe. Es kann geschlussfolgert werden, dass Lebermetastasen stromaärmer sind als ihre Primärtumoren. Dennoch sind beide Tumorkompartimente deutlich desmoplastisch. Diese Arbeitet leistet einen Beitrag dazu, das Tumorstroma des Pankreaskarzinoms im KPC-Mausmodell genauer zu charakterisieren und den Einfluss von Stromakomponenten auf das Gesamtüberleben zu untersuchen.
Schlagwörter: Pankreaskarzionom; Stromaanlyse; KPC Mausmodell