Signal transduction by the essential nucleotide second messenger cyclic di-AMP in Bacillus subtilis

by Larissa Krüger
Doctoral thesis
Date of Examination:2020-12-11
Date of issue:2021-01-15
Advisor:Prof. Dr. Jörg Stülke
Referee:Prof. Dr. Ralf Ficner
Referee:Prof. Dr. Fabian Commichau
Referee:Dr. Sarah Adio
Referee:Prof. Dr. Stefanie Pöggeler
Referee:Prof. Dr. Henning Urlaub
Persistent Address: http://dx.doi.org/10.53846/goediss-8334

 

 

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Abstract

English

Bacillus subtilis, as a soil inhabitant, has to adapt to rapidly changing osmotic conditions. The response to these osmotic changes represents one of the most critical issues in the lifecyle of bacteria, and the tight regulation of the responsive pathways is of particular importance to guarantee survival. The nucleotide second messenger cyclic di AMP is involved in the response to changes in the external salinity as it plays a pivotal role in the control of the uptake of potassium ions. To guarantee tight regulation, c di AMP controls the two high-affinity potassium importers KtrAB and KimA on both transcriptional and protein level. The low-affinity potassium channel KtrCD, however, is controlled by the nucleotide on protein level only. In this study we revealed a second mode of regulation and showed that KtrCD is converted into a high-affinity potassium channel in the presence of glutamate. On the other hand, the affinity of the glutamate transporter GltT for glutamate depends on the availability of potassium ions. This mutual regulation highlights the importance of maintaining the balance of the two counterions and gives c di AMP a special role in monitoring the ionic strength of the cytoplasm. This is supported by our observation that not only potassium, as previously reported, but also glutamate is toxic for a strain lacking the nucleotide second messenger. In this study we isolated suppressor mutants that allow growth of a c-di-AMP-free strain exposed to glutamate. Characterization of these suppressors revealed that they contain pairs of mutations affecting glutamate and potassium homeostasis, phospholipid biosynthesis, motility, and respiration. Several independent mutations affected ybeC and the protein was identified as a novel glutamate transporter and renamed to AimA (amino acid importer A). The diversity of suppressor mutations suggests that the second messenger likely impacts other cellular processes in addition to the homeostasis of potassium and glutamate. Moreover, we could show that the response to potassium limitation includes the small signal transduction protein DarB (c-di-AMP receptor B). DarB is conserved among Firmicutes but its function has remained elusive until now. Low extracellular potassium levels lead to the presence of the apo-form of DarB. This ligand-free version of the protein binds the dual function (p)ppGpp synthetase/hydrolase Rel and activates ribosome-independent (p)ppGpp synthesis. Accumulation of (p)ppGpp activates the stringent response which induces a global cellular reprogramming, including the downregulation of ribosomal activities. This becomes important under extreme potassium limitation as potassium ions display crucial components of the active ribosome. The regulation of translational processes by a c-di-AMP-receptor through activation of the stringent response displays a novel event of second messenger crosstalk. Together with the suppressor analysis this work demonstrates a central role of c-di-AMP in the control of potassium and glutamate homeostasis, which is linked to the stringent response in B. subtilis.
Keywords: Bacillus subtilis; Second messenger signaling; cyclic di-AMP; Potassium; Glutamate; Nucleotide crosstalk

German

Bacillus subtilis muss sich als Bodenbewohner an sich rasch verändernde osmotische Bedingungen anpassen. Die Reaktion auf diese osmotischen Veränderungen stellt ein kritisches Problem im Lebenszyklus von Bakterien dar, und die strenge Regulierung der Reaktionswege ist von essentieller Bedeutung. Der Nukleotid-Sekundärbotenstoff zyklisches di-AMP ist an der Reaktion auf Veränderungen des externen Salzgehalts beteiligt, da er eine zentrale Rolle bei der Kontrolle der Kaliumionenaufnahme spielt. Um eine genaue Regulation zu gewährleisten, kontrolliert c-di-AMP die beiden hochaffinen Kaliumimporter KtrAB und KimA sowohl auf Transkriptions-, als auch auf Proteinebene. Der niedrigaffine Kaliumkanal KtrCD wird jedoch nur auf Proteinebene durch das Nukleotid kontrolliert. In dieser Arbeit deckten wir einen zweiten Modus der Regulation auf und zeigten, dass KtrCD in Gegenwart von Glutamat in einen hochaffinen Kaliumkanal umgewandelt wird. Außerdem hängt die Affinität des Glutamat-Transporters GltT für Glutamat von der Verfügbarkeit von Kaliumionen ab. Diese gegenseitige Regulation unterstreicht die Bedeutung der Aufrechterhaltung des Gleichgewichts der beiden Gegenionen und verleiht c di AMP eine besondere Rolle bei der Überwachung der Ionenstärke des Zytoplasmas. Dies wird durch unsere Beobachtung unterstützt, dass nicht nur Kalium, wie bereits bekannt, sondern auch Glutamat für einen c-di-AMP-freien Stamm toxisch ist. Hier wurden Suppressormutationen charakterisiert, die das Wachstum eines solchen Stammes in Gegenwart von Glutamat ermöglichen. Diese Untersuchung ergab, dass sie Paare von Mutationen enthalten, die die Glutamat- und Kaliumhomöostase, die Phospholipidbiosynthese, die Motilität und die Atmung beeinflussen. Mehrere unabhängige Mutationen beeinflussten ybeC und das Protein wurde als neuer Glutamat-Transporter identifiziert und in AimA (Aminosäure-Importer A) umbenannt. Die Vielfalt der Suppressormutationen lässt vermuten, dass der Botenstoff neben der Homöostase von Kalium und Glutamat auch andere zelluläre Prozesse beeinflusst. Darüber hinaus konnten wir zeigen, dass die Reaktion auf die Kaliumlimitation das kleine Signaltransduktionsprotein DarB (c di AMP-Rezeptor B) einschließt. DarB ist unter den Firmicuten konserviert, aber seine Funktion war bisher unbekannt. Niedrige extrazelluläre Kaliumspiegel führen zum Vorhandensein der Apo-Form von DarB. Diese Form des Proteins bindet die (p)ppGpp-Synthetase/Hydrolase Rel und aktiviert die ribosomenunabhängige (p)ppGpp-Synthese. Die Akkumulation von (p)ppGpp aktiviert die stringente Reaktion, die eine globale zelluläre Reprogrammierung einschließlich der Herunterregulierung der ribosomalen Aktivitäten auslöst. Dies wird bei extremer Kaliumlimitation wichtig, da Kaliumionen entscheidende Komponenten des aktiven Ribosoms darstellen. Die Regulation translationaler Prozesse durch c-di-AMP-Rezeptoren durch Aktivierung der stringenten Antwort ist ein neues Beispiel des Second Messenger-Crosstalks. Zusammen mit der Suppressoranalyse zeigt diese Arbeit eine zentrale Rolle von c-di-AMP bei der Kontrolle der Kalium- und Glutamathomöostase auf, die mit der stringenten Reaktion in B. subtilis verbunden ist.
 
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