| dc.contributor.advisor | Rizzoli, Silvio O. Prof. Dr. | |
| dc.contributor.author | Hoff, Merle | |
| dc.date.accessioned | 2021-02-05T10:37:06Z | |
| dc.date.available | 2021-03-01T23:50:03Z | |
| dc.date.issued | 2021-02-05 | |
| dc.identifier.uri | http://hdl.handle.net/21.11130/00-1735-0000-0005-1565-2 | |
| dc.identifier.uri | http://dx.doi.org/10.53846/goediss-8420 | |
| dc.identifier.uri | http://dx.doi.org/10.53846/goediss-8420 | |
| dc.language.iso | deu | de |
| dc.rights.uri | http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/ | |
| dc.subject.ddc | 610 | de |
| dc.title | Kombinatorische Analyse von Nanobody-markierten Epitopen zur Proteinbestimmung | de |
| dc.type | doctoralThesis | de |
| dc.title.translated | Combinatorial analysis of nanobody-detected epitopes for protein identification | de |
| dc.contributor.referee | Rizzoli, Silvio O. Prof. Dr. | |
| dc.date.examination | 2021-02-22 | |
| dc.description.abstractger | Die Fähigkeit, Proteine zu bestimmen und zu messen, ist für die biologische und medizinische Forschung von großer Bedeutung, um einen Einblick in die subzellulären Organisationen und Funktionen zu erhalten, die auf der Zusammenarbeit und der Organisation von mehreren tausend Proteinen beruhen. Damit physiologische oder pathologische Veränderungen im Organismus im Zusammenhang mit den verschiedenen Proteinkonzentrationen gebracht werden können, sind Verfahren zur multiplexen Bildgebung unumgänglich. Die derzeitigen Technologien ähneln sich dahingehend, dass für jedes zu bestimmende Protein ein/zwei spezifische Antikörper für die Detektion benötigt wird/werden. Durch diesen Umstand wird die Gesamtzahl der gleichzeitig zu identifizierenden Antigene auf drei bis vier Antigene pro Immunfärbung begrenzt, weil nur eine entsprechende Anzahl von Antikörpern simultan eingesetzt werden kann. Aus diesem Grund befasste sich die vorliegende Arbeit mit der Entwicklung einer auf Nanobodies basierenden Epitop-Analyse von Proteinen, die ein einfaches, unkompliziertes und schnelles Verfahren für die multiplexe Bildgebung darstellt. Der Ansatz dieser Arbeit beruht auf der Idee, dass jedes Protein aufgrund eines in seiner Aminosäuresequenz enthaltenden einzigartigen Epitop-Satzes markiert ist, der sich je nach Protein in Art, Anzahl und Kombination unterscheidet. Infolge des individuellen Epitop-Satzes können die Proteine mittels des spezifischen Bindungsverhaltens von Nanobodies in Bezug auf die enthaltenden Epitope identifiziert werden. Für jedes zu identifizierende Protein wird ein dem Epitop-Satz entsprechender, spezifisch gebundener Satz an Nanobodies ermittelt. Anhand des Nanobody-Satzes kann wiederum mithilfe der Epitop-Analyse ein Rückschluss auf den jeweiligen Epitop-Satz vollzogen werden, aufgrund dessen Einzigartigkeit jedes Protein identifiziert werden kann. In dieser Arbeit erfolgte die Verifizierung der Epitop-Analyse anhand der Identifizierung und der hochauflösenden Bildgebung von 15 künstlich designten Proteinkonstrukten mithilfe von vier Nanobodies.
Die in diesem Projekt eingesetzten vier Nanobodies besitzen also keine spezifische Affinität für ein einzelnes Protein, sondern nur für bestimmte Epitope, die Teil künstlich designter Proteinkonstrukte sind. Die 15 Proteinkonstrukte sind so aufgebaut, dass an jedes der 15 Proteine jeweils eine bestimmte Kombination der vier für die Nanobodies spezifischen Epitope gekoppelt wurde. So ist jede Epitop-Kombination nur einmalig in dem Verbund mit einem Protein vertreten. Die Nanobodies sind daher in der Lage, diejenigen Konstrukte zu binden, die innerhalb ihrer Aminosäuresequenz das entsprechende spezifische Epitop vertreten.
Zur Überprüfung der Eignung der Epitop-Analyse wurden die Proteinkonstrukte in Zellen transfiziert, koexprimiert und anschließend wurden die verschiedenen Epitope unter Verwendung der kombinatorischen Epitop-Analyse detektiert. Die Detektion erfolgte durch die Messung der Signale der fluorophorgekoppelten Nanobodies. Die Fluorophor-Kopplung beruhte auf dem Verfahren der Maleimid-Markierung. Anhand der spezifischen Sätze an detektierten Nanobody-Signalen konnte jedes transfizierte Konstrukt identifiziert und in der Zelle lokalisiert werden. Die Eignung der Epitop-Analyse wurde zunächst als singleplexes und anschließend auch als multiplexes Verfahren überprüft. Für die Erschaffung einer multiplex-transifizierten Zelle wurden die Wege der Fusion, der multiplen Transfektion und des Gibson Assemblys getestet. Die multiple Transfektion von Zellen hat sich als erfolgversprechendste Methode erwiesen. Damit eine spektrale Überlagerung der fluorophorgekoppelten Nanobodies während der Auswertung der Epitop-Analyse vermieden werden konnte, wurde neben dem Verfahren der simultanen Immunfärbung auch eine sequenzielle Immunfärbung der Proteinkonstrukte durchgeführt.
Das Ziel dieser Arbeit ist die Entwicklung der auf Nanobodies basierenden Epitop-Analyse zur Bestimmung von Proteinen. In den Untersuchungen zur Anwendung der Epitop-Analyse hat sich gezeigt, dass durch die Verwendung von „n“ Nanobodies während der Epitop-Analyse „2n-1“ Proteine identifiziert werden können. Damit können die auf Antikör-pern basierenden Verfahren der Proteinbestimmung nach dem Eins-zu-eins-Prinzip umgan-gen werden. Die auf Nanobodies-basierende Epitop-Analyse stellt somit eine wertvolle Alter-native zu derzeit existierenden Nachweisverfahren dar und könnte zukünftig für die Analyse multipler zellbiologischer Fragestellungen eingesetzt werden. Zur Präzisierung und Simplifikation der Epitop-Analyse sollten in weiteren Forschungen fluoreszenzmessende Softwareprogramme unterstützend zur Auswertung hinzugezogen werden. | de |
| dc.description.abstracteng | The ability to identify and measure proteins is important in biological and medical research. It enables insights into the subcellular organizations and functions that rely on the collaboration and organization of thousands of proteins. Methods for multiplex imaging are essential for investigating protein-related changes in organisms, such as physiological or pathological changes in protein concentrations. Current technologies are similar to each other in that one/two specific antibodies are required per protein for detection. As a result, the total number of antigens to be identified concurrently is limited to three to four antigens per immunostaining, because only one corresponding number of antibodies can be used simultaneously. For this reason, this dissertation deals with the development of a nanobody-based epitope analysis of proteins, which is a simple, uncomplicated and fast method for multiplex imaging. The approach of this work is based on the idea that every protein is marked on the basis of a unique set of epitopes contained in its amino acid sequence. This set of epitopes differ in type, number and combination depending on the protein. As a result of the individual epitope set, the proteins can be identified by means of the specific binding behavior of nanobodies in relation to the epitopes they contain. For each protein to be identified, a specifically bound set of nanobodies corresponding to the epitope set is determined. On the basis of the nanobody set, using an-epitope-based analysis, the respective epitope set and subsequently the respective protein is analyzed. For this kind of analysis the uniqueness of a protein is crucial. In this dissertation, the epitope analysis was verified by identifying and imaging 15 artificially designed protein constructs using four nanobodies.
The four nanobodies used in this project have no specific affinity for a single protein, but only for certain epitopes that are part of artificially designed protein constructs. The 15 protein constructs are structured in such a way that a certain combination of the four epitopes specific for the nanobodies was coupled to each of the 15 proteins. Each epitope combination is thus only represented once in the composite with a protein. The nanobodies are able to bind those constructs, which represent the corresponding specific epitope within their amino acid sequence. To check the suitability of the epitope analysis for protein identification, the protein constructs were transfected into cells, co-expressed and visualized using fluorescent nanobodies. Subsequently, protein epitopes were detected using the combinatorial epitope analysis. The coupling between nanobody and a fluorophore was based on the maleimide labeling technique. Using the specific sets of detected nanobody signals, each transfected construct was identified and localized in the cell. The suitability of the epitope analysis was first verified as a singleplex and then as a multiplex method. The following methods were applied to create a cell transfected with multiple protein: 1.) fusion, 2.) multi-transfection and 3.) Gibson assembly. A multi-transfection of cells proved to be the most promising method. In order to avoid a spectral superimposition of the fluorophore-coupled nanobodies during the evaluation of the epitope analysis, a complementary sequential immunostaining of the protein constructs was carried out.
The aim of this dissertation is the development of a nanobody-based epitop analysis for protein determination. The investigation into the application of epitope show that “2n-1” proteins can be successfully identified by using “n” nanobodies during epitope analysis. This means that the classical antibody-based methods of protein determination according to the one-to-one principle can be bypassed. The epitope analysis based on nanobodies represents a valuable alternative to existing detection methods and is a powerful approach possibly suitable for future analyses of several biological cell issues too. Future research and evaluation should include fluorescence measuring software programs in order for precision and simplification of epitope analysis. | de |
| dc.contributor.coReferee | Schwappach-Pignataro, Blanche Prof. Dr. | |
| dc.contributor.thirdReferee | Kehlenbach, Ralph Prof. Dr. | |
| dc.contributor.thirdReferee | Mausberg, Rainer Prof. Dr. | |
| dc.subject.ger | Epitop-Analyse | de |
| dc.subject.ger | Bildgebung | de |
| dc.subject.ger | multiplex | de |
| dc.subject.ger | Nanobody | de |
| dc.subject.eng | epitop analysis | de |
| dc.subject.eng | nanobody | de |
| dc.subject.eng | imaging | de |
| dc.subject.eng | multiplex | de |
| dc.identifier.urn | urn:nbn:de:gbv:7-21.11130/00-1735-0000-0005-1565-2-3 | |
| dc.affiliation.institute | Medizinische Fakultät | de |
| dc.subject.gokfull | Medizin (PPN619874732) | de |
| dc.subject.gokfull | Labormedizin (PPN619875658) | de |
| dc.subject.gokfull | Zytopathologie {Medizin} (PPN619875712) | de |
| dc.description.embargoed | 2021-03-01 | |
| dc.identifier.ppn | 1747705950 | |
| dc.creator.birthname | Wassmann | de |