Antagonistic fluorescent pseudomonads cause evasion of the plant pathogen Verticillium by controlling hyphal growth and polarity

von Kai Nesemann geb. Schaedle
Kumulative Dissertation
Datum der mündl. Prüfung:2021-01-12
Erschienen:2021-04-09
Betreuer:Prof. Dr. Gerhard H. Braus
Gutachter:Prof. Dr. Rolf Daniel
Gutachter:Prof. Dr. Andrea Polle
Gutachter:Prof. Dr. Oliver Gailing
Zum Verlinken/Zitieren: http://dx.doi.org/10.53846/goediss-8537

 

 

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Zusammenfassung

Englisch

Abstract Soil borne phytopathogenic Verticillia constitute increasing yield losses. Due to a lack of resistant cultivars as well as appropriate fungicides, the usage of biocontrol agents like fluorescent pseudomonads might be a promising option to ecologically manage the pest. The impact of different mycotoxins against Verticillium is highly media dependent. Pseudomonas fluorescens DSM8569, an isolate from B. napus rhizosphere, is able to inhibit fungal growth on surfaces of rich medium containing high glucose independent of phenazines or GacA/GacS-regulated toxins but not on a complex medium with plant pectins and amino acids. In microfluidic interaction channels, this inhibitive potential has been quantified to 80 % growth reduction. An impact of a phenazine gene cluster on Verticillium growth on surface media could only be determined in a glucose environment. In microchannels filled with liquid pectins and amino acids, a phenazine gene cluster could increase the suppressive potential of the bacterium for about 30 %. An influence on Verticillium growth by genes responsible for single mycotoxins of a GacA/GacS regulation could not be proven. The sensor kinase GacS (a global regulator) as well as the response regulator GacA fulfill essential functions for fungal control especially on pectins and amino acids with an inhibition potential of approx. 30 %. In total, the entire regulation system leads to the strongest observed fungal suppression in this study of more than 90 %. Hyphal polarity has been altered in presence of the bacterium. The strongest effect was observed for P. protegens CHA0 potentially expressing a diverse mycotoxin cocktail resulting in more than 80 % curled hyphal tips compared to parallel hyphae in the fungal control without bacterium. This phenomenon might be interpreted as an evading strategy followed by Verticillium that tries to escape the bacterial impact. Fungal genetic response was addressed by sequencing the Verticillium transcriptome after co-cultivation with P. protegens CHA0. About one third of the total gene set was up-regulated in presence of the bacterium, including genes involved in detoxification possibly as a direct reaction to bacterial toxicity. The fungus presumably follows a detoxification and evasion strategy and drives back processes required for nutrient up-take like plant polysaccharide hydrolases associated to its reduced growth activity. In summary it can be considered, that in a static environment Verticillia have developed strategies to physically avoid fluorescent Pseudomonas by adapting their growth rates and by changing their growth direction. Transferring these findings gained from an artificial setup in a microfluidic confrontation design to the natural heterogeneous environment in the rhizosphere with areas of diverse suppressivness, Verticillium might potentially escape from a threatening to a more appropriate ecological niche for survival and to approach new host plant roots for infection. If evasion is no option for the fungus, like it is during artificial agitated co-cultivation or under natural conditions in the soil being located in a very widely spread Pseudomonas population, Verticillium possibly utilizes its capability to detoxify antifungal toxins to cope with bacterial antagonism.
Keywords: Verticillium; Pseudomonas; biocontrol; RNAseq; gacA/gacS

Deutsch

Zusammenfassung Bodenbürtige phytopathogene Verticillien führen zu enormen Ernteausfällen. Da bislang keine resistenten Kultursorten oder geeignete Fungizide zur Verfügung stehen, könnte die Verwendung von Biokontrollbakterien wie fluoreszierenden Pseudomonaden eine ökologische Alternative sein. Die Wirkung verschiedener Mykotoxine gegen Verticillium ist äußerst medienabhängig. Pseudomonas fluorescens DSM8569, ein natürliches Isolat aus der Rhizosphäre von B. napus ist in der Lage ohne Phenazine und GacA/GacS-regulierte Toxine das Pilzwachstum auf reichhaltigem Oberflächenmedium mit hohem Glukosegehalt zu inhibieren, allerdings nicht auf einem Komplexmedium mit Pektinen und Aminosäuren. In mikrofluidischen Interaktionskanälen konnte dieses Inhibitionspotential auf 80 % Wachstumsreduzierung quantifiziert werden. Ein signifikanter Einfluss eines Phenazine-Genclusters auf das Wachstum von Verticillium auf Oberflächenmedien konnte nur unter Glukosebedingungen bestimmt werden. In Mikrokanälen, gefüllt mit einem Pektin-Aminosäure-Medium, konnte das Phenazine-Gencluster das Hemmpotential des Bakteriums zusätzlich um ca. 30 % steigern. Gene für einzelne Mykotoxine, die durch ein GacA/GacS System reguliert werden, haben jeweils keinen individuellen Einfluss auf das Wachstum von Verticillium. Die Sensorkinase GacS (ein globaler Regulator) sowie der Antwortregulator GacA zeigen essentielle Funktionen für die Pilzkontrolle, vor allem auf einem Pektin-Aminosäure-Medium mit einem Hemmpotential von ca. 30 %. Insgesamt führt ein vollständiges Regulationssystem, zur stärksten beobachteten Pilzhemmung in dieser Studie von über 90 %. Auch die Polarität der Hyphen wurde unter Pseudomonaseinfluss verändert. Der stärkste Effekt wurde durch P. protegens CHA0 verursacht, mit mehr als 80 % gekräuselten Hyphenspitzen im Vergleich zu parallel wachsenden Hyphen der Pilzkontrolle ohne Bakterium. Dieses Phänomen könnte als Vermeidungsstrategie durch Verticillium interpretiert werden, welcher versucht dem intensiven Einfluss des Bakteriums zu entkommen um geeignetere Wurzeln zu infizieren. Pilzliche Antworten wurden durch Sequenzierung des Verticillium Transkriptoms nach Kokultivierung mit P. protegens CHA0 untersucht. Etwa ein Drittel aller Gene wurde in Anwesenheit des Bakteriums hochreguliert, inklusive der Gene, die an Detoxifizierung beteiligt sind. Dies könnte möglicherweise als direkte Antwort auf die bakterielle Toxizität interpretiert werden. Vermutlich verfolgt der Pilz eine Fluchtstrategie und fährt Prozesse zurück, die für die Nährstoffaufnahme entscheidend sind, wie etwas Pflanzen-Polysaccharid-Hydrolasen, und während reduzierter Wachstumsaktivität weniger benötigt werden. Zusammenfassend lässt sich festhalten, dass Verticillium unter statischen Bedingung Strategien entwickelt hat, um bestimmten fluoreszierenden Pseudomonaden räumlich auszuweichen, etwa durch Anpassung ihrer Wachstumsrate sowie Änderung Ihrer Wachstumsrichtung. Versucht man diese Erkenntnisse vom artifziellen Versuchsaufbau in einem mikrofluidischen Konfrontationsdesign auf die natürlichen heterogenen Bedingungen in der Rhizosphäre mit Bereichen unterschiedlicher Suppressivität zu übertragen, so lässt sich schlussfolgern, dass Verticillium potentiell versucht, lebensfeindliche Bereich zu verlassen und besser geeignete ökologische Lebensräume zu besetzten. Hier könnte der Pilz womöglich erhöhte Überlebenschancen vorfinden und somit die Möglichkeit neue Pflanzenwurzeln zu infizieren. Wenn für den Pilz die Fluchtstrategie keine Möglichkeit darstellt, etwa während schwenkender Kokultivierung im Labor oder unter natürlichen Bedingung im Boden in großräumigen Bereichen hoher Pseudomonaskonzentration, könnte Verticillium möglicherweise seine Fähigkeit nutzen, um antimykotische Toxine zu detoxifizieren und somit zu versuchen, dem bakteriellen Antagonismus standzuhalten.
 
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