Analysis of the role of Arabidopsis extra-large G protein 2 in cerk1-4-dependent cell death signalling

by Julia Anders née Frenzel
Doctoral thesis
Date of Examination:2021-04-29
Date of issue:2021-06-24
Advisor:Prof. Dr. Volker Lipka
Referee:Prof. Dr. Volker Lipka
Referee:PD Dr. Marcel Wiermer
Persistent Address: http://dx.doi.org/10.53846/goediss-8671

 

 

Files in this item

Name:Dissertation Julia Anders ohne CV.pdf
Size:17.0Mb
Format:PDF

The following license files are associated with this item:

Abstract

English

Plants perceive microbe-associated molecular patterns (MAMPs) via so called pattern-recognition receptors (PRRs) at the plasma membrane, which activates an immune response. Heterotrimeric G proteins are intracellular signal transducers, which consist of a Gα subunit and a Gβγ-dimer. Heterotrimeric G proteins typically form a complex at the plasma membrane and are known to play roles in almost all aspects of plant life. In plants, receptor-like kinases (RLKs) and receptor-like cytosolic kinases (RLCKs) were found to interact with heterotrimeric G proteins in a MAMP-responsive way, which activates cell death and defense against pathogens. Besides one classical Gα subunit, Arabidopsis has three extra-large G proteins (XLG1-3), of which XLG2/3 are involved in immunity. The Gβ subunit AGB1 and Gγ subunits AGG1/2 are also involved in defense signalling. Plants perceive fungal pathogens via the chitin-elicitor receptor kinase 1 (CERK1). The cerk1-4 mutation is known to cause a phenotype with exaggerated cell death upon pathogen inoculation, early senescence, and higher resistance against biotrophic powdery mildews. Mutations that suppress the cerk1-4 cell death phenotype were identified via a suppressor screen, including two mutations within the XLG2 gene: xlg2-2 (knock-out) and xlg2-3 (E293K). This study focused on the analysis of the role of XLG2 in cerk1-4-dependent cell death signalling. Venus-labeled XLG2 variants were generated and analyzed in planta via confocal laser scanning microscopy (CLSM) with focus on plasma membrane and nuclear localization. The functionality of XLG2 variants in cerk1-4 cell death signalling was analyzed using complementation studies. These studies revealed that the plasma membrane localization is important for functionality of XLG2 in cerk1-4 cell death signalling. The nuclear localization was found to be dispensable for this cell death promoting function of XLG2. Pathogen inoculation using Erysiphe cruciferarum (Ec) caused an increase in abundance of XLG2 and xlg2 variants. In unchallenged Arabidopsis plants, XLG2 localized mainly to the cell periphery (plasma membrane as well as cytosolic signal at the periphery), while in Ec infected pavement cells XLG2 also accumulated in the nucleus. Several XLG2 mutant variants were analyzed, which showed mainly nuclear localization and lost functionality in cerk1-4 cell death signalling. Further, these mainly nuclear localizing XLG2 variants showed a difference in the apparent molecular mass compared to wildtype XLG2 in Western Blots. The relevance of the XLG2 Gα activity for cerk1-4 cell death signalling and subcellular localization of XLG2 was analyzed. Two xlg2 varaints, one with impaired nucleotide binding (potentially nucleotide-free) and the other potentially GTPase-dead (likely constitutively bound to GTP), did not cause changes in the localization of XLG2 or functionality in cerk1-4 cell death signalling. In contrast to the canonical Gα subunit GPA1, XLGs have a plant-specific N-terminal elongation with a highly conserved cysteine-rich region. XLG2 cysteine-rich region mutant variants with cysteines exchanged for alanine (C-A), showed mainly nuclear localization, a lower apparent molecular mass in Western Blots, and lost functionality in cerk1-4 cell death signalling. Accordingly, the cysteine-rich region seems to be important for correct localization of XLG2 and functionality in this cell death signalling pathway. XLG2 is known to bind the AGB1-AGG1/2-dimer at the plasma membrane. In order to analyze the subcellular localization of XLG2 in the absence of the Gβγ-dimer, G protein mutant Arabidopsis were transiently transformed via particle bombardment for expression of Venus-XLG2. The Gβγ-dimer was found to have a weak effect on plasma membrane association of XLG2. In the absence of the Gβγ-dimer, Venus-XLG2 was found to accumulate less to the cell periphery and more inside the nucleus. At late Ec infection time-points, XLG2 was found to associate with haustoria, which are fungal feeding structures formed during compatible plant-microbe interactions. Different XLG2 variants with changed localization were included in the analysis of this co-localization. XLG2 variants with wildtype-like or without a nuclear XLG2 pool co-localized with the haustorial periphery, while for mainly nuclear localizing xlg2 variants significantly less labeled Ec haustoria were observed. Propidium iodide staining and bright field images revealed that XLG2 accumulates in the plant-derived encasement, which typically surrounds fully developed haustoria.
Keywords: plant microbe interactions; powdery mildew; Extra large G protein 2; cerk1-4; Arabidopsis thaliana; Erysiphe cruciferarum; Confocal laser scanning microscopy

German

Pflanzen nehmen Mikroben-assoziierte molekulare Muster (MAMPs) mit Hilfe von sogenannten Muster-erkennenden Rezeptoren (PRRs) an der Zellmembran wahr, wodurch eine Immunantwort ausgelöst wird. Heterotrimere G-Proteine sind an der intrazellulären Signaltransduktion beteiligt und sind aus einer Gα-Untereinheit und einer Gβγ-Untereinheit zusammengesetzt. Heterotrimere G-Proteine formen typischerweise einen Komplex an der Zellmembran und sind dafür bekannt in fast allen Bereichen des pflanzlichen Lebens eine Rolle zu spielen. In Pflanzen interagieren heterotrimere G-Proteine mit Rezeptor-ähnlichen Kinasen (RLK) und Rezeptor-ähnlichen zytosolischen Kinasen (RLCK) in Abhängigkeit zur MAMP-Wahrnehmung, was sowohl den Zelltod als auch die Abwehr von Pathogenen aktiviert. Neben der klassischen Gα-Untereinheit lassen sich in Arabidopsis drei extra-große G-Proteine (XLG1-3) finden, von welchen XLG2-3 an der Immunität beteiligt sind. Die Gβ-Untereinheit AGB1 und die Gγ-Untereinheiten AGG1/2 sind ebenfalls an der Abwehr-Signalgebung beteiligt. Pflanzen nehmen pilzliche Pathogene mit Hilfe eines Chitin-erkennenden Rezeptors (CERK1) wahr. Die cerk1-4 Mutation ist dafür bekannt einen Phänotyp mit erhöhtem Zelltod als Reaktion auf Pathogen-Inokulation zu verursachen, sowie eine früher einsetzende Seneszenz and erhöhte Resistenz gegen den biotrophen Mehltau. Mutationen, welche den cerk1-4-bedingten Zelltod-Phänotyp supprimieren, wurden mit Hilfe eines Suppressor-Screening-Verfahrens identifiziert, einschließlich zweier Mutationen innerhalb des XLG2-Gens: xlg2-2 (knock-out) und xlg2-3 (E293K). Im Fokus dieser Studie stand die Analyse von XLG2 in der cerk1-4-vermittelten Zelltod-Signalgebung. Venus-markierte XLG2 Varianten wurden generiert und mit Hilfe von konfokaler Laser-Scanning Mikroskopie (CLSM) in planta untersucht, wobei der Fokus vor allem auf der Lokalisierung an der Zellmembran und im Zellkern lag. Die Funktionalität der XLG2 Varianten in der cerk1-4-vermittelten Zelltod-Signalgebung wurde durch Komplementation-Untersuchungen geprüft. Diese Untersuchungen zeigten, dass die Zellmembran-Lokalisierung für die Funktion von XLG2 in der cerk1-4-vermittelten Zelltod-Signalgebung wichtig ist. Die Zellkern-Lokalisierung war dagegen entbehrlich für die Zelltod-fördernde Funktion von XLG2. Pathogen-Inokulation mit Erysiphe cruciferarum (Ec) verursachte eine Erhöhung der Abundanz von XLG2 Varianten. In ungestressten Arabidopsis-Pflanzen lokalisierte XLG2 hauptsächlich an der Zellperipherie (Zellmembran und zytosolisches Signal an der Peripherie eingeschlossen), während in Ec-infizierten Epidermiszellen XLG2 ebenfalls im Zellkern akkumulierte. Es wurden verschiedene XLG2 Mutanten analysiert, die hauptsächlich im Zellkern lokalisierten und gleichzeitig ihre Funktion in der cerk1-4-vermittelten Zelltod-Signalgebung verloren haben. Des Weiteren zeigten diese vorwiegend Zellkern-lokalisierenden XLG2 Varianten eine veränderte scheinbare Molekularmasse in Western Blots im Vergleich zum Wildtyp-XLG2. Die Relevanz der XLG2 Gα-Aktivität für die cerk1-4-vermittelte Zelltod-Signalgebung und die subzelluläre Lokalisierung wurden ebenfalls analysiert. Zwei XLG2 Varianten, eine mit eingeschränkter Nucleotid-Bindefähigkeit (wahrscheinlich Nucleotid-frei) und die andere mit potenziell defekter GTPase-Aktivität (wahrscheinlich konstitutiv an GTP gebunden), veränderten weder die Lokalisierung von XLG2 noch die Funktionalität in der cerk1-4-vermittelten Zelltod-Signalgebung. Im Gegensatz zu der klassischen Gα-Untereinheit GPA1 haben XLGs eine Pflanzen-spezifische N-terminale Verlängerung mit einer Cystein-reichen Region. XLG2 Mutanten betreffend der Cystein-reichen Region, mit durch Alanin ausgetauschten Cysteinen (C-A), zeigten hauptsächlich Zellkern Lokalisierung, eine niedrigere scheinbare Molekularmasse in Western Blots und verloren die Funktionalität in der cerk1-4-vermittelten Zelltod-Signalgebung. Entsprechend ist die Cystein-reiche Region wahrscheinlich wichtig für die Lokalisierung von XLG2 und die Funktion in der Zelltod-Signalgebung. XLG2 ist dafür bekannt die AGB1-AGG1/2-Untereinheiten an der Zellmembran zu binden. Um die subzelluläre Lokalisierung von XLG2 in Abwesenheit der Gβγ-Untereinheit zu untersuchen, wurden G-Protein Mutanten Arabidopsis mit Hilfe des Teilchen-Bombardements transient transformiert und exprimierten daraufhin Venus-XLG2. Es wurde beobachtet, dass die Gβγ-Untereinheit einen schwachen Effekt auf die Zellmembran-Assoziation von XLG2 hat. In Abwesenheit der Gβγ-Untereinheit akkumulierte Venus-XLG2 weniger an der Zellperipherie und mehr innerhalb des Zellkerns. Zu späten Ec-Infektionszeitpunkten wurde beobachtet, dass XLG2 mit Haustorien assoziiert. Haustorien sind pilzliche Versorgungsstrukturen, die sich während kompatiblen Pflanzen-Mikroben-Interaktionen ausbilden. Verschiedene XLG2 Varianten mit veränderter Lokalisierung wurden daraufhin bezüglich dieser Kolokalisierung untersucht. XLG2 Varianten mit Wildtyp-ähnlicher Lokalisierung, und ohne den im Zellkern-akkumulierten Anteil, kolokalisierten mit der Haustorien-Peripherie, während hauptsächlich Zellkern-akkumulierende XLG2 Varianten signifikant weniger häufig mit Ec Haustorien kolokalisierten. Propidiumiodid-Färbung und Hellfeld Bilder zeigten, dass XLG2 in der pflanzen-abgeleiteten Umhüllung akkumulierte, welche typischerweise voll ausgebildete Haustorien umgibt.
 
Statistik