Zelluläre Elektrophysiologie und Calciumhomöostase an Kardiomyozyten aus induzierten pluripotenten Stammzellen von einem Patienten mit Fallot'scher Tetralogie

Dülk, Rebekka

dc.contributor.advisor	Voigt, Niels Prof. Dr.
dc.contributor.author	Dülk, Rebekka
dc.date.accessioned	2021-08-26T09:14:22Z
dc.date.available	2021-09-14T00:50:22Z
dc.date.issued	2021-08-26
dc.identifier.uri	http://hdl.handle.net/21.11130/00-1735-0000-0008-58F0-6
dc.identifier.uri	http://dx.doi.org/10.53846/goediss-8798
dc.language.iso	deu	de
dc.rights.uri	http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/
dc.subject.ddc	610	de
dc.title	Zelluläre Elektrophysiologie und Calciumhomöostase an Kardiomyozyten aus induzierten pluripotenten Stammzellen von einem Patienten mit Fallot'scher Tetralogie	de
dc.type	doctoralThesis	de
dc.title.translated	Cellular Electrophysiology and Calcium Handling in Induced-Pluripotent Stem Cell Derived Cardiomyocytes from a Patient with Tetralogy of Fallot	de
dc.contributor.referee	Voigt, Niels Prof. Dr.
dc.date.examination	2021-09-07
dc.description.abstractger	Einleitung: Die Fallot’sche Tetralogie (Tetralogy of Fallot, TOF) ist der häufigste angeborene zyanotische Herzfehler und viele Patienten entwickeln im Laufe der Erkrankung Herzrhythmusstörungen (sowohl atrialen als auch ventrikulären Ursprungs). Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, zelluläre elektrophysiologische Mechanismen und Veränderungen der Calcium(Ca2+)-Homöostase zu identifizieren, welche zur Arrhythmogenese in TOF-Patienten beitragen könnten. Deshalb wurden aus induzierten Stammzellen gewonnene Kardiomyozyten (induced-pluripotent stem cell derived cardiomyocytes, iPSC-CMs) von einem Patienten mit Fallot’scher Tetralogie und dessen gesunden Vater als Kontrolle (Ctl) untersucht. Methoden: Der L-Typ-Ca2+-Strom (ICa,L) wurde mittels Whole-Cell-Patch-Clamp-Technik im Voltage-Clamp-Modus gemessen. Simultan wurde der korrespondierende systolische Ca2+-Transient mithilfe von Epifluoreszenz aufgezeichnet (Fluo-3 als Ca2+-Indikator). Ferner wurde die Strom-Spannungs-Beziehung des ICa,L und seine Supprimierbarkeit durch Nifedipin (1 µM und 10 µM) untersucht. Der Ca2+-Gehalt des sarkoplasmatischen Retikulums (SR) wurde durch Applikation von Koffein (10 mM) bestimmt. Außerdem wurde die Aktivität der SR-Ca2+-ATPase (SERCA2a, Isoform des Herzens) berechnet. Ferner wurden Aktionspotentialmessungen mittels Perforated-Patch-Clamp-Technik im Current-Clamp-Modus durchgeführt. Vor den Aktionspotentialmessungen wurden die Zellen über ein elektrisches Feld stimuliert und anschließend nur schlagende Zellen untersucht. Alle Experimente wurden bei 37 °C durchgeführt. Ergebnisse: Auf depolarisierende Spannungssprünge zeigten sowohl Ctl- als auch TOF-iPSC-CMs einen Nifedipin-sensitiven ICa,L mit typischer glockenförmiger Strom-Spannungs-Beziehung. Die Spannungsabhängigkeit der Einwärtsströme mit einer maximalen Stromdichte zwischen -10 mV und +10 mV war in Ctl- und TOF-iPSC-CMs vergleichbar. In den Ctl-iPSC-CMs fiel eine starke Abhängigkeit des ICa,L von der Kulturzeit auf: Ältere Zellen (Tag 47-66 der Differenzierung) exprimierten verglichen mit jüngeren Zellen (Tag 29-42 der Differenzierung) einen größeren Strom mit einer höheren Varianz der Stromdichte. Deshalb wurden nur junge iPSC-CMs (Tag 27-42) für Experimente zur Ca2+-Homöostase verwendet. In den TOF-iPSC-CMs zeigte sich im Vergleich zu den Ctl-iPSC-CMs ein signifikant größerer ICa,L. Dieser triggerte einen ebenfalls höheren systolischen Ca2+-Transienten. Interessanterweise war auch die diastolische Ca2+-Konzentration in den TOF-Zellen signifikant erhöht. Überraschenderweise unterschied sich die Ca2+-Konzentration des SRs zwischen Ctl- und TOF-iPSC-CMs nicht. Die Abklingphase des koffeininduzierten Ca2+-Transienten, welche v.a. auf einen Ca2+-Ausstrom durch den Natrium-Calcium-Austauscher (NCX) zurückzuführen ist, war zwischen Ctl- und TOF-Zellen vergleichbar. Dagegen war die SERCA2a-Aktivität in den TOF-iPSC-CMs im Vergleich zu den Ctl-iPSC-CMs erhöht. Die Aktionspotentialmessungen ergaben ein vergleichbares Ruhemembranpotential und vergleichbare Aktionspotentialamplituden in Ctl- und TOF-iPSC-CMs. In jungen TOF-Zellen (Tag 33-36) war die Aktionspotentialdauer im Vergleich zu jungen Ctl-Zellen (Tag 30-42) verkürzt. Dagegen zeigte sich in älteren Zellen (Tag 63-76) eine tendenziell längere Aktionspotentialdauer in der TOF-Gruppe. Die Berechnung der Repolarisationsfraktion ergab in Abhängigkeit vom Ruhemembranpotential keinen eindeutigen Unterschied zwischen Ctl- und TOF-iPSC-CMs. Interessanterweise zeigten ca. 55 % der iPSC-CMs der TOF-Gruppe spontane Membrandepolarisationen in Form später Nachdepolarisationen. Solche Ereignisse traten in der Ctl-Gruppe nicht auf. Diskussion: Es gilt zu beachten, dass iPSC-CMs unreife Zellen sind und ihre elektrophysiologischen Eigenschaften von Kultur- und Messbedingungen abhängen. Die größere Stromdichte, welche in den älteren Ctl-Zellen beobachtet wurde, ist höchstwahrscheinlich auf eine zunehmende Zellreifung zurückzuführen. In den TOF-iPSC-CMs zeigte sich im Vergleich zur Ctl-Gruppe ein größerer ICa,L, welcher einen höheren systolischen Ca2+-Transienten triggerte. Die erhöhte diastolische Ca2+-Konzentration in den TOF-Zellen könnte auf ein SR-Ca2+-Leck, verursacht durch eine Dysfunktion der Ryanodinrezeptoren hindeuten. Das freigesetzte Ca2+ wird z.T. über den NCX aus dem Zystosol entfernt. Dieser elektrogene Prozess kann zu Membrandepolarisationen führen. Die erhöhte Anfälligkeit der TOF-Zellen für späte Nachdepolarisationen könnte zur Entwicklung von ektoper Aktivität und kardialen Arrhythmien in Patienten mit Fallot’scher Tetralogie beitragen. Die erhöhte SERCA2a-Aktivität in den TOF-iPSC-CMs könnte Teil eines Mechanismus zur Kompensation der erhöhten diastolischen Ca2+-Konzentration sein, um somit das Ca2+-Flussgleichgewicht der Zelle zu erhalten und die gestörte Ca2+-Homöostase teilweise auszugleichen. Aktionspotentialmessungen in isolierten iPSC-CMs mittels Perforated-Patch-Clamp-Technik sind potentiell anfällig für methodische Fehler. Deshalb müssen die Ergebnisse der Aktionspotentialmessungen mit Vorsicht interpretiert werden. Dementsprechend konnte nicht abschließend geklärt werden, ob die beobachteten Unterschiede zwischen Ctl- und TOF-Gruppe auf eine veränderte Zellreifung zwischen Ctl- und TOF-iPSC-CMs oder auf einen methodischen Fehler zurückzuführen sind. Insgesamt trägt die vorliegende Arbeit zur generellen Charakterisierung der zellulären Elektrophysiologie und intrazellulären Ca2+-Homöostase von iPSC-CMs bei.	de
dc.description.abstracteng	Introduction: Tetralogy of Fallot (TOF) is the most common congenital cyanotic heart defect and many patients with TOF proceed to suffer from arrhythmias (both atrial and ventricular). The aim of this thesis was to identify cellular electrophysiological mechanisms and cytosolic calcium (Ca2+) handling abnormalities that may contribute to arrhythmogenesis in TOF patients. Therefore, induced-pluripotent stem cell derived cardiomyocytes (iPSC-CMs) from a patient with Tetralogy of Fallot and his healthy father as control (Ctl) were investigated. Methods: To measure the L-type Ca2+ current (ICa,L), the whole-cell patch-clamp technique in voltage-clamp mode was used. Cytosolic Ca2+ was recorded simultaneously by epifluorescence (Fluo-3 as Ca2+-indicator). Furthermore the current-voltage relationship of the ICa,L and its suppression by Nifedipine (1 µM and 10 µM) were investigated. Sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ content was measured by application of caffeine (10 mM). Activity of the SR Ca2+ ATPase (SERCA2a, isoform of the heart) was also calculated. Additionally, action potential recordings were performed using the perforated-patch-clamp technique in current-clamp mode. Prior to action potential recordings, cells were field stimulated and only contracting cells were measured. All experiments were performed at 37 °C. Results: Upon depolarizing voltage-steps, iPS-CMs from both groups showed a Nifedipine-sensitive ICa,L with a typical bell-shaped current-voltage relationship. Voltage-dependence of inward currents was comparable in Ctl and TOF iPS-CMs with maximum current activation between -10 mV and +10 mV. In Ctl iPSC-CMs, culture-time dependence of ICa,L was observed: Older cells (day 47-66 of differentiation) expressed a greater current with higher variance of current densities, compared to younger cells (day 29-42 of differentiation). Therefore, only young iPSC-CMs (d27-42) were used for further Ca2+ handling experiments. In TOF iPSC-CM, the amplitude of ICa,L was significantly increased, compared to Ctl iPSC-CMs. The greater ICa,L also triggered a higher systolic Ca2+ transient. Interestingly, diastolic Ca2+ concentration was also significantly increased in TOF cells. Surprisingly, the SR Ca2+ content was not found to be different between Ctl- and TOF iPSC-CMs. Furthermore, decay of caffeine-evoked Ca2+ transient, which is predominately attributable to cytosolic Ca2+ removal by sodium-calcium-exchanger (NCX), was comparable in TOF and Ctl. However, SERCA2a activity was greater in TOF iPSC-CMs compared to Ctl iPSC-CMs. Action potential recordings revealed comparable resting membrane potentials and action potential amplitudes between Ctl- and TOF iPSC-CMs. In young TOF cells (d33-36) action potential duration was shorter, compared to young Ctl cells (d30-42). In contrast, in older cells (d63-76), action potential duration tended to be greater in the TOF group. Calculation of repolarization fraction and its dependence on resting membrane potential did not show a clear difference between Ctl- and TOF iPSC-CMs. Interestingly, about 55 % of iPS-CMs from the TOF group exhibited spontaneous membrane depolarizations (delayed afterdepolarizations, DADs), whereas these events were absent in Ctl iPSC-CMs. Discussion: It must be highlighted that iPSC-CMs are immature cells and that their electrophysiological properties depend on culture and experimental conditions. The higher current density of ICa,L found in older Ctl cells is most likely to be caused by advanced cell maturation. In TOF iPSC-CMs, ICa,L was greater and also triggered a bigger systolic Ca2+ transient, compared to the Ctl group. The higher diastolic Ca2+ concentration in TOF cells may point to increased SR calcium leak, which could be caused by ryanodine receptor dysfunction. The released calcium is removed from the cytosol, in part, by the NCX. This electrogenic process may initiate membrane depolarizations. The increased susceptibility of TOF cells to DADs may contribute to the development of ectopic activity and cardiac arrhythmias in patients with Tetralogy of Fallot. Increased SERCA2a activity observed in TOF iPSC-CMs could be part of a mechanism to compensate for the higher diastolic Ca2+ concentration, thereby contributing to the maintenance of cellular Ca2+ flux balance and enabling impaired Ca2+ handling to be partially corrected. Action potential measurements in isolated iPSC-CMs by perforated patch-clamp technique are potentially susceptible to methodological errors. Therefore, the results of the action potential recordings must be interpreted with care. Thus, it is not possible to conclude whether the differences found between Ctl- and TOF group are due to differences in cell maturation between Ctl- and TOF-cells, or to methodological errors. Overall this thesis contributes to general characterization of the electrophysiology and intracellular Ca2+ handling of iPSC-CMs.	de
dc.contributor.coReferee	Toischer, Karl Prof. Dr.
dc.subject.ger	Fallot'sche Tetralogie	de
dc.subject.ger	iPSC-CM	de
dc.subject.ger	L-Typ-Ca2+-Strom	de
dc.subject.ger	intrazelluläre Ca2+-Konzentration	de
dc.subject.ger	SR Ca2+-Gehalt	de
dc.subject.ger	Aktionspotentiale	de
dc.subject.ger	Arrhythmien	de
dc.subject.eng	Tetralogy of Fallot	de
dc.subject.eng	iPSC-CM	de
dc.subject.eng	L-type-Ca2+-current	de
dc.subject.eng	intracellular Ca2+-concentration	de
dc.subject.eng	SR Ca2+ content	de
dc.subject.eng	Action potentials	de
dc.subject.eng	Arrhythmias	de
dc.identifier.urn	urn:nbn:de:gbv:7-21.11130/00-1735-0000-0008-58F0-6-3
dc.affiliation.institute	Medizinische Fakultät	de
dc.subject.gokfull	Medizin (PPN619874732)	de
dc.description.embargoed	2021-09-14
dc.identifier.ppn	1767955170
dc.creator.birthname	Härer	de

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Human- und Zahnmedizin [2872]

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