Untying Gordian knots: The evolution and biogeography of the large European apomictic polyploid Ranunculus auricomus plant complex

by Kevin Karbstein née Glass
Cumulative thesis
Date of Examination:2021-10-08
Date of issue:2021-10-19
Advisor:Prof. Dr. Elvira Hörandl
Referee:Prof. Dr. Elvira Hörandl
Referee:PD Dr. Sven Bradler
Persistent Address: http://dx.doi.org/10.53846/goediss-8888

 

 

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Abstract

English

Polyploidy, the presence of two or more full genomic complements, repeatedly occurs across the tree of life. In plants, not only the economic but particularly the evolutionary importance is overwhelming. Polyploidization events, probably connected to key innovations (e.g., vessel elements or the carpel), occurred frequently in the evolutionary history of flowering plants, which are the most species-rich group in the plant kingdom (ca. 370,000 species) and contain 30–70% neopolyploids. Polyploidy and hybridization (i.e., allopolyploidy) are particularly considered to create biotypes with novel genomic compositions and to be key factors for subsequent speciation and macroevolution. In plants, both processes are frequently connected to apomixis, i.e., the reproduction via asexually-formed seeds. However, the enigmatic phenomenon of plant speciation accompanied by polyploidy and apomixis is still poorly understood despite tremendous progress in the field of genomics. The question of “What is a species?” is of highest priority for evolutionary biologists: Species are the fundamental units for biodiversity, and further evolutionary and ecological research relies on well-defined entities. Evolutionarily young plant species complexes offer a unique opportunity to study plant speciation and accompanying processes. They usually comprise a few sexual progenitor species, and numerous polyploid, partly apomictic, hybrid derivatives. In apomictic lineages, the lack of recombination and cross-fertilization can result in numerous clonal lineages with fixed morphological and ecological traits (agamospecies). Nevertheless, even recognizing and delimiting the sexual progenitors of species complexes is methodically challenging due to low genetic divergence, possible hybrid origins, ongoing gene flow, and/or incomplete lineage sorting (ILS). Integrative approaches using both genomic and morphometric data for disentangling the young progenitors are still lacking so far. The biogeography and evolution of those plant complexes is even more challenging. Apomicts frequently occupy larger areas or more northern regions compared to their sexual relatives, a phenomenon called geographical parthenogenesis (GP). GP patterns usually have a Pleistocene context because climatic range shifts in temperate to boreal zones offered frequent opportunities for interspecific hybridization, probably giving rise to apomixis in the Northern Hemisphere. Factors shaping GP patterns are still controversially discussed. GP has been widely attributed to advantages of apomicts caused by polyploidy and uniparental reproduction, i.e., fixed levels of high heterozygosity leading to increased stress tolerance, and self-fertility leading to better colonizing capabilities. On the one hand, complex interactions of genome-wide heterozygosity, ploidy, reproduction mode (sexual versus asexual), and climatic environmental factors shaping GP have not been studied enough. On the other hand, potential disadvantages of sexual progenitors due to their breeding system on fitness and genetic diversity have received even less attention. Finally, alongside biogeography, the reticulate relationships and genome composition and evolution of young, large polyploid plant species complexes have not yet been deciphered comprehensively. Besides challenges attributed to numerous numbers of polyploidization and hybridization events, bioinformatic analyses are also often hampered by missing information on progenitors, ploidy levels, and reproduction modes. The European apomictic polyploid Ranunculus auricomus (goldilock buttercup) plant complex is well-suited to study all the aforementioned issues. The majority of goldilock buttercups probably arose from hybridization of a few sexual progenitors, leading to more than 800 described, morphologically highly diverse agamospecies. Sexuals are estimated to have speciated less than 1.0 million years ago, and agamospecies are probably much younger. In this thesis, using R. auricomus as a model system, I examined the recalcitrant and hitherto poorly understood phylogenetic, genomic, and biogeographical relationships of young polyploid apomictic plant complexes. I developed a comprehensive theoretical and bioinformatic workflow, starting with analyzing the evolution of the sexual progenitor species, continuing with unraveling reproduction modes and biogeography of apomictic polyploids, and ending up with revealing the reticulate origins and genome composition and evolution of the polyploid complex. Spanning up to 251 populations and 87 R. auricomus taxa Europe-wide, this work gathered data of 97,312 genomic loci (RADseq), 663 nuclear genes (target enrichment), and 71 plastid regions, and 1,474 leaf ploidy, 4,669 reproductive seed, 284 reproductive crossing (seed sets), as well as 1,593 geometric morphometric measurements. First of all, phylogenomics based on RADseq, nuclear gene, and geometric morphometric data supported the lumping of the twelve described sexual morphospecies into five newly circumscribed progenitor species. These species represent clearly distinguishable genetic main lineages or clusters, which are both well geographically isolated and morphologically differentiated: R. cassubicifolius s.l., R. envalirensis s.l., R. flabellifolius, R. marsicus, and R. notabilis s.l. Mainly within-clade reticulate relationships, missing geographical isolation, and a lack of distinctive morphological characters led to this taxonomic treatment. Interestingly, allopatric speciation events took place ca. 0.83–0.58 million years ago during a period of severe climatic oscillations, and were probably triggered by vicariance processes of a widespread European forest-understory ancestor. Sexual species re-circumscriptions were additionally supported by population crossing experiments. Besides inbreeding depression, outbreeding benefits, and sudden self-compatibility, crossings also revealed a lack of reproductive barriers among some of the formerly described morphospecies. Moreover, flow cytometric ploidy and reproductive, RADseq, and environmental data were combined into a genetically informed path analysis based on Generalized Linear Mixed Models (GLMMs). The analysis unveiled a complex European GP scenario, whereby diploids compared to polyploids showed significantly higher sexuality (percent of sexual seeds), more petals (petaloid nectary leaves), and up to three times less genome-wide heterozygosity. Surprisingly, sexuality was positively associated with solar radiation and isothermality, and heterozygosity was positively related to temperature seasonality. Results fit the southern distribution of diploid sexuals and suggest a higher resistance of polyploid apomicts to more extreme climatic conditions. Finally, a self-developed, multidisciplinary workflow incorporating all previously gathered data demonstrated, for the first time, the predominantly allopolyploid origin, genome composition, and post-origin genome evolution of the R. auricomus complex. Taxa were organized in only three to five supported, north-south distributed clades or cluster, each usually containing diploid sexual progenitor species. Allopolyploidizations involved two to three different diploid sexual subgenomes per event. Only one autotetraploid event was detected. Allotetraploids were characterized by subgenome dominance and enormous post-origin evolution, i.e., Mendelian segregation of hybrid generations, back-crossing to parents, and/or gene flow due to facultative sexuality of apomicts. Four diploid sexual progenitors and a previously unknown, nowadays extinct progenitor, probably gave rise to the more than 800 taxa of the European R. auricomus complex. Analyses also showed that the majority of analyzed polyploid agamospecies are non-monophyletic and similar morphotypes probably originated multiple times. The lack of monophyly suggests a comprehensive taxonomic revision of the entire complex. In the General Discussion, I combine my thesis results with existing plant studies on diploid sexual and polyploid apomictic phylogenetics, biogeography, and composition and genome evolution of young species complexes. I explain the taxonomic conclusions and how species complexes link micro- and macroevolutionary processes. Finally, I give conclusions of my thesis and an outlook of the project and the field of polyploid phylogenetics.
Keywords: Phylogenomics; Rad-Seq; Hyb-Seq; Ranunculus auricomus; Polyploidy; Apomixis; Speciation; Plants; Geometric Morphometrics; Geographical Parthenogenesis; Genomics; Species Concepts; Nuclear genes; Plastid regions

German

Polyploidie, das Vorhandensein von zwei oder mehr vollständigen Chromosomensätzen, tritt wiederholt über den gesamten Baum des Lebens auf. Bei Pflanzen ist die wirtschaftliche, aber vor allem auch die evolutionäre Bedeutung überwältigend. Polyploidisierungen, wahrscheinlich verbunden mit Schlüsselinnovationen (z.B. die Entwicklung der Gefäßelemente oder des Fruchtblattes), traten in der Evolution der Blütenpflanzen häufig auf. Blütenpflanzen sind die artenreichste Gruppe im Pflanzenreich mit ca. 370,000 Arten und umfassen 30–70% Neopolyploide. Es wird angenommen, dass Polyploidie und Hybridisierung (Allopolyploidie) besonders zur Entstehung von Biotypen mit neuartiger genomischer Zusammensetzung beitragen und damit Schlüsselfaktoren für nachfolgende Artbildungen und Makroevolution sind. Bei Pflanzen sind beide Prozesse häufig mit Apomixis, der Reproduktion über asexuell gebildete Samen, verbunden. Das rätselhafte Phänomen der von Polyploidie und Apomixis begleiteten Artbildung ist jedoch trotz enormer Fortschritte auf dem Gebiet der Genomik noch immer kaum verstanden. Die Frage „Was ist eine Art?“ hat für Evolutionsbiologen höchste Priorität: Arten sind die Grundlage der Biodiversitätsforschung, und die evolutionäre und ökologische Forschung stützt sich auf gut definierte Einheiten. Evolutionär junge Artkomplexe bieten eine einzigartige Möglichkeit die Artbildung bei Pflanzen und deren begleitende Prozesse zu erforschen und zu verstehen. Sie umfassen meist wenige sexuelle Stammarten und zahlreiche polyploide, teilweise apomiktische, hybridogene Derivate. Das Fehlen von Rekombination und Kreuzbestäubung in apomiktischen Linien kann zu einer Vielzahl klonaler Hybridlinien mit fixierten morphologischen und ökologischen Merkmalen führen (Agamospezies). Selbst das Erkennen und Abgrenzen der sexuellen Stammarten ist aufgrund geringer genetischer Divergenz, eventuellen hybridogenen Ursprüngen, stetigem Genfluss und/oder unvollständiger genetischer Auftrennung der Abstammungslinien (ILS) methodisch herausfordernd. Integrative Ansätze, die sowohl genomische als auch morphometrische Daten verwenden, um die jungen Stammarten aufzutrennen, fehlen bisher. Die Biogeographie und Evolution der Artkomplexe ist weitaus komplexer. Apomikten besetzen im Vergleich zu ihren sexuellen Verwandten häufig größere Areale oder sind in nördlicheren Regionen verbreitet, ein Phänomen, das als Geographische Parthenogenese (GP) bezeichnet wird. GP-Muster haben meist einen pleistozänen Kontext. Klimatische Schwankungen in den gemäßigten und borealen Zonen boten häufig Möglichkeiten zur interspezifischen Hybridisierung, was wahrscheinlich auch zur Entstehung von Apomixis auf der Nordhalbkugel geführt hat. Faktoren, die diese Muster erzeugen, werden immer noch kontrovers diskutiert. GP-Muster wurden bisher oft den Vorteilen apomiktischer Populationen aufgrund von (Allo)polyploidie und uniparentaler Fortpflanzung zugeschrieben: Fixierte, hohe Heterozygotie führt zu einer erhöhten Stresstoleranz, und Selbstfertilität bedingt eine bessere Kolonisierungsfähigkeit. Einerseits sind die komplexen Wechselwirkungen von genomweiter Heterozygotie, Ploidie, Reproduktionssmodi (sexuell versus asexuell) und klimatischer Umweltfaktoren auf GP-Muster nicht ausreichend untersucht worden, andererseits wurden potentielle Nachteile sexueller Stammarten aufgrund ihres Fortpflanzungssystems auf Fitness und genetische Vielfalt bisher kaum betrachtet. Schließlich sind neben der Biogeographie die retikulate Evolution und die genomische Zusammensetzung und Evolution junger, großer polyploider Pflanzenartenkomplexe noch nicht detailliert entschlüsselt worden. Neben Herausforderungen, die auf eine hohe Anzahl an Polyploidisierungs- und Hybridisierungsereignissen zurückzuführen sind, werden bioinformatische Analysen oft durch fehlende Informationen zu sexuellen Stammarten, Ploidiegraden und Reproduktionsmodi erschwert. Der europäische, polyploid-apomiktische Ranunculus auricomus (Gold-Hahnenfuß) Pflanzenkomplex ist gut geeignet, um alle aufgeworfenen Fragestellungen zu untersuchen. Der Komplex entstand wahrscheinlich durch unzählige Hybridisierungen weniger sexueller Stammarten. Bisher wurden mehr als 800 morphologisch sehr diverse Agamospezies (Derivate) beschriebenen. Die sexuellen Stammarten werden weniger als 1.0 Millionen Jahren alt geschätzt, und die Agamospezies sind wahrscheinlich noch viel jünger. In meiner Dissertation habe ich unter Verwendung des R. auricomus Komplexes als Modellsystem die bisher wenig verstandenen phylogenetischen, genomischen und biogeographischen Beziehungen junger, polyploider Pflanzengruppen untersucht. Ich habe einen umfassenden theoretischen und bioinformatischen Workflow entwicklelt, beginnend mit der Untersuchung der Evolution der sexuellen Stammarten, über die Entschlüsselung der Reproduktionsmodi und Biogeographie polyploid-apomiktischer Derivate bis hin zur Aufdeckung der retikulaten Ursprünge und Genomzusammensetzung und -evolution des Polyploidkomplexes. Diese Arbeit umfasst 251 Populationen und 87 R. auricomus Taxa europaweit. Die Analysen basieren auf 97,312 genomischen Loci (RADseq), 663 Kerngenen (target enrichment) und 71 Plastidenregionen, und 1,474 Blattploidie-, 4,669 Reproduktions- Samen-, 284 Kreuzungs- (Samenansatz), und 1,593 Morphometrie-Messungen. Phylogenomische Daten basierend auf RADseq, Kerngenen und geometrischer Morphometrie unterstützten die Zusammenlegung der zwölf sexuellen Morphospezies in fünf neu klassifizierte Stammarten. Diese Arten stellen klar unterscheidbare genetische Hauptlinien oder Cluster dar, die sowohl geographisch gut isoliert als auch morphologisch klar differenziert sind: R. cassubicifolius s.l., R. envalirensis s.l., R. flabellifolius, R. marsicus und R. notabilis s.l. Enorme retikulate Beziehungen innerhalb der Kladen, die nicht-vorhandene geographische Isolation und das Fehlen markanter morphologischer Merkmale haben zu diesem taxonomischen Konzept geführt. Allopatrische Artbildungsereignisse fanden interessanterweise vor ca. 0.83–0.58 Millionen Jahren während enormer klimatischer Schwankungen statt und wurden wahrscheinlich durch Vikarianzprozesse aus einer weit verbreiteten europäischen Stammart ausgelöst. Darüber hinaus wurde die neue Umschreibung der sexuellen Stammarten durch Populationskreuzungsexperimente unterstützt. Kreuzungen zeigten neben Inzuchtdepression, Auszuchtvorteilen und plötzlicher Selbstkompatibilität auch völlig fehlende Reproduktionsbarrieren zwischen einigen Morphospezies. Darüber hinaus wurden durchflusszytometrische Ploidy- und Reproduktions-, genomweite RADseq- und klimatische Umweltdaten in einer genetisch-informierten Pfadanalyse basierend auf Generalisierten Linearen Gemischten Modellen (GLMMs) kombiniert. Die Analyse hat ein komplexes europäisches GP-Szenario aufgedeckt, in der Diploide im Vergleich zu Polyploiden eine signifikant höhere Sexualität (Prozent sexueller Samen), mehr Blütenblätter (petaloide Nektarblätter) und bis zu dreimal weniger genomweite Heterozygotie zeigten. Die Sexualität war überaschenderweise positiv mit Sonneneinstrahlung und Isothermalität verbunden, und die Heterozygotie zeigte einen positiven Zusammenhang mit der Temperatursaisonalität. Die Ergebnisse stimmen mit der südlichen Verbreitung diploid-sexueller Populationen überein und deuten auf eine höhere Resistenz polyploid-apomiktischer Populationen gegenüber extremeren klimatischen Bedingungen hin. Ein neu entwickelter, multidisziplinärer Workflow, der alle bisherigen Daten einbezieht, deckte zum ersten Mal den weitestgehend allopolyploiden Ursprung und die Genomzusammensetzung und -evolution des R. auricomus Komplexes auf. Die Taxa waren in nur drei bis fünf unterstützten, nord-süd verbreiteten Kladen oder Clustern organisiert, die jeweils meistens diploid-sexuelle Stammarten enthielten. Allopolyploidisierungsereignisse bezogen jeweils zwei bis drei verschiedene, diploid-sexuelle Subgenome ein. Es wurde nur ein autotetraploides Ereignis nachgewiesen. Allotetraploide Genome sind gekennzeichnet durch Subgenomdominanz und einer enormen Evolution nach ihrer Entstehung (z.B. Mendelsche Segregation der Hybridgenerationen, Rückkreuzungen zu Elternarten und Genfluss aufgrund fakultativer Sexualität der Apomikten). Die über 800 Taxa des europäischen R. auricomus-Komplexes sind vermutlich aus vier diploiden Stammarten und eine bisher unbekannte, aktuell wahrscheinlich ausgestorbene Stammart, entstanden. Analysen zeigten auch, dass die Mehrzahl der beschriebenen polyploiden Agamospezies nicht monophyletisch ist und ähnliche Morphotypen wahrscheinlich mehrfach entstanden sind. Eine umfassende taxonomische Überarbeitung des gesamten Komplexes ist daher angebracht. In der Allgemeinen Diskussion kombiniere ich die Ergebnisse meiner Dissertation mit bereits existierenden Pflanzenstudien zur diploid-sexuellen und polyploid-apomiktischen Phylogenetik, Biogeographie und Genomzusammensetzung und -evolution junger Artkomplexe. Ich gebe zudem taxonomische Schlussfolgerungen und erkläre wie Artkomplexe mikro- und makroevolutionäre Prozesse miteinander verbinden. Abschließend gebe ich ein Fazit über die Ergebnisse meiner Dissertation und einen Ausblick für das laufende Forschungsprojekt und der Forschungsdisziplin der polyploiden Phylogenetik.
 
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