Aufbau einer Silicanin-1-haltigen Modellmembran des Silicafällungsvesikels aus Thalassiosira pseudonana

Schwarz, Philipp Werner

dc.contributor.advisor	Steinem, Claudia Prof. Dr.
dc.contributor.author	Schwarz, Philipp Werner
dc.date.accessioned	2021-12-23T11:30:52Z
dc.date.available	2022-02-23T00:50:10Z
dc.date.issued	2021-12-23
dc.identifier.uri	http://hdl.handle.net/21.11130/00-1735-0000-0008-59D3-6
dc.identifier.uri	http://dx.doi.org/10.53846/goediss-9026
dc.identifier.uri	http://dx.doi.org/10.53846/goediss-9026
dc.language.iso	deu	de
dc.publisher	Niedersächsische Staats- und Universitätsbibliothek Göttingen	de
dc.rights.uri	http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/
dc.subject.ddc	540	de
dc.title	Aufbau einer Silicanin-1-haltigen Modellmembran des Silicafällungsvesikels aus Thalassiosira pseudonana	de
dc.type	doctoralThesis	de
dc.title.translated	Preparation of a silicanin-1-containing model membrane of the silica deposition vesicle from Thalassiosira pseudonana	de
dc.contributor.referee	Steinem, Claudia Prof. Dr.
dc.date.examination	2021-02-25
dc.description.abstractger	Silicapolykondensation in Silicafällungsvesikeln (SDVs) von Kieselalgen führt zur Bildung von Valven und Gürtelbändern, um die Biosilica-Zellwand nach der Zellteilung zu vervollständigen. Dieses Biosilica zeigt speziesspezifische nano-strukturierte Poren. Die Rolle der SDV-Membran in der Silicabiogenese ist bis heute nicht gut verstanden. Modellmembranen können dabei helfen, den Einfluss von Lipiddoppelschichten und Membranbestandteilen (wie Transmembranproteine) auf Silicafällung und -morphogenese sowie ihre Wechselwirkungen mit silicafällenden Biomolekülen zu beleuchten. Gesamtlipidanalysen der Kieselalgenspezies Thalassiosira pseudonana wurden mit GC-FID und LC-MS/MS durchgeführt. Die Lipidzusammensetzungen von zwei synchronisierten Kulturen in unterschiedlichen Zellzyklusstadien wurden miteinander verglichen, um Rückschlüsse über die SDV-Membranzusammensetzung zu ziehen. Die Lipidklassen Phosphatidylcholin (PC), Phosphatidylethanolamin (PE), Phosphatidsäure (PA) und Lysophosphatidylcholin (LPC) wiesen höhere Anteile in SDV-angereicherten Zellen auf, sodass ihre Beteiligung an dem Aufbau der SDV-Membran angenommen wird. Zudem wurden MGDG, SQDG, PG, DGDG und PC mittels TLC-GC-FID als polare Hauptlipidklassen identifiziert, wobei Thalassiosira pseudonana in seiner Lipidverteilung Cyclotella meneghiniana aus der Literatur ähnelt. Weiterhin wurde rekombinantes Silicanin-1 (Sin1, ein Transmembranprotein) isoliert und hinsichtlich seiner Sekundärstruktur und pH-abhängigen Selbstaggregation charakterisiert. Das Protein konnte mit einer Effizienz von 30-60 % in PC/PE-haltige Vesikel rekonstituiert werden. Die Sin1-Orientierung wurde mittels Chymotrypsinverdaus und Anti-Sin1-Western Blottings bestimmt. Proteoliposomen wurden in Silicafällungsexperimenten eingesetzt. Vesikel zeigten dabei eine Fällungsaktivität, die für Sin1 aufgrund einer niedrigen Proteinkonzentration nicht eindeutig nachgewiesen werden konnte. Es konnte eine planare festkörperunterstützte Modellmembran mittels Vesikelfusion mit einer Lipidmonoschicht präpariert werden. CLSM und FRAP wurden genutzt, um die diffusiven Eigenschaften der Lipiddoppelschicht zu bestätigen. In der Membran eingebautes Sin1 wurde durch fluoreszente Antikörper visualisiert. Diese SDV-Modellmembran ermöglicht zukünftige Untersuchungen von Membraninteraktionen mit SDV-assoziierten Biomolekülen.	de
dc.description.abstracteng	Silica polycondensation occurring in diatom organelles called silica deposition vesicles (SDVs) leads to valve and girdle band formation to complete the biosilica cell wall after cell division. This biosilica shows species-specific nano-patterned porous structures. The SDV membrane’s role in silica biogenesis is not well understood to date. The use of model membranes may help to elucidate the influence of lipid bilayers and membrane constituents like transmembrane proteins via interactions with silica precipitating biomolecules on silica precipitation and morphogenesis. In the first section, total lipid analysis of the diatom species Thalassiosira pseudonana was performed with GC-FID and LC-MS/MS. The lipid composition of two synchronized cultures in different cell cycle stages was compared to draw conclusions about SDV membrane lipid composition. The lipid classes phosphatidylcholine (PC) and phosphatidylethanolamine (PE) next to phosphatidic acid (PA) and lysophosphatidylcholine (LPC) were found elevated in valve SDV enriched cells. Therefore, their use in SDV membranes is assumed. Furthermore, the relative profile of main polar lipid classes MGDG, SQDG, PG, DGDG and PC was determined by means of TLC, followed by GC-FID. Thalassiosira pseudonana showed similar polar lipid class distributions like Cyclotella meneghiniana from literature. In the second section, recombinant Silicanin-1 (Sin1, a SDV transmembrane protein) was isolated and characterized regarding its secondary structure and pH dependent self-aggregation by means of CD-spectroscopy and DLS, respectively. This protein was reconstituted into vesicles with an efficiency of 30–60 % for PC/PE containing vesicles. Sin1 orientation was determined by chymotrypsin digest and anti-Sin1 Western blotting. Proteoliposomes were used in silica precipitation experiments and it was found that vesicles exhibit silica precipitation properties whereas a clear statement about Sin1 regarding direct silica precipitation or a synergistic effect in presence of LCPA was not possible due to low protein concentration. Finally, a protocol was successfully established to form a planar solid supported model membrane by vesicle fusion with lipid monolayer. CLSM and FRAP were used to confirm the lipid bilayer’s diffusive properties according to literature values. Sin1 confined to the membrane was visualized via fluorescent antibodies. This SDV model membrane enables future investigations of membrane interactions with SDV associated biomolecules.	de
dc.contributor.coReferee	Feußner, Ivo Prof. Dr.
dc.contributor.thirdReferee	Enderlein, Jörg Prof. Dr.
dc.contributor.thirdReferee	Friedl, Thomas Prof. Dr.
dc.contributor.thirdReferee	Kruss, Sebastian Dr.
dc.contributor.thirdReferee	Tittmann, Kai Prof. Dr.
dc.subject.ger	CLSM	de
dc.subject.ger	Comizellisierung	de
dc.subject.ger	Diatomeen	de
dc.subject.ger	FRAP	de
dc.subject.ger	Kieselalgen	de
dc.subject.ger	Lipidanalyse	de
dc.subject.ger	Lipidomics	de
dc.subject.ger	Modellmembran	de
dc.subject.ger	SDV	de
dc.subject.ger	Silicafällungsvesikel	de
dc.subject.ger	Silicanin-1	de
dc.subject.ger	Thalassiosira pseudonana	de
dc.subject.eng	CLSM	de
dc.subject.eng	comicellization	de
dc.subject.eng	diatoms	de
dc.subject.eng	FRAP	de
dc.subject.eng	lipid analysis	de
dc.subject.eng	lipidomics	de
dc.subject.eng	model membrane	de
dc.subject.eng	SDV	de
dc.subject.eng	silica deposition vesicle	de
dc.subject.eng	silicanin-1	de
dc.subject.eng	Thalassiosira pseudonana	de
dc.identifier.urn	urn:nbn:de:gbv:7-21.11130/00-1735-0000-0008-59D3-6-5
dc.affiliation.institute	Fakultät für Chemie	de
dc.subject.gokfull	Chemie (PPN62138352X)	de
dc.description.embargoed	2022-02-23
dc.identifier.ppn	178365080X

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