Etablierung, Validierung und Anwendung einer gaschromatographisch-massenspektrometrischen Methode zur Analyse von Testosteron und 17α-OH-Progesteron im Serum

Abstract

Ziele: Die Arbeit hatte die Etablierung und Validierung einer robusten, spezifischen und sensitiven GC-NCI-MS Methode zum Ziel, um Testosteron und 17α-OH-Progesteron im Serum zuverlässig quantifizieren zu können. Anschließend wurde die Methode mit dem Siemens ADVIA Centaur Immunoassay zur Testosteronanalyse verglichen. Hintergrund der Arbeit ist die mangelnde Richtigkeit und Sensitivität der Steroidhormonanalyse mit Immunoassays, inbesondere bei Hormonanylsen in geringen Konzentrationen, wie z.B. Testosteron bei Frauen und Kindern.

Methode: Die Methode umfasste die Zugabe von deuterierten Internen Standard zu 1 ml Serum, gefolgt von Flüssig-Flüssig-Extraktion mit Ethylacetat und einem Clean-up mittels Festphasenextraktion. Die angereicherten und aufgereinigten Proben können mit Pentafluor¬benzyl¬hydroxylamin-hydrochlorid und MSTFA/TMCS (99:1) erfolgreich derivatisiert und im Anschluss in die GC-MS injiziert werden. Die Methode zeigt eine exzellente chromatographische Trennung. Testosteron und 17-OH-Progesteron wurden im Selected Ion Monitoring detektiert, die Quantifizierung erfolgte durch den Vergleich der Verhältnisse der Peakflächen zwischen Internen Standard und Analyten. Für den Methodenvergleich, zwischen der GC-MS Methode und dem Siemens ADVIA Centaur Immunoassay, wurde Testosteron in 10 Proben von Männern und 20 Proben von Kindern und Frauen analysiert.

Ergebnisse: In dem für Männer physiologischen Konzentrationsbereich (2,62 -9,29 ng/ml) konnte eine sehr gute Übereinstimmung der Analysenergebnisse beider Methoden gezeigt werden (r= 0,97). Im Gegensatz dazu fiel im niedrigen Konzentrationsbereich aus Seren von Frauen und Kindern (0,05 - 0,51 ng/ml) eine geringe Übereinstimmung (r= 0,77) der Messergebnisse auf, wobei hier mit dem untersuchten Immunassay im Mittel um 158,9 % höhere Konzentrationen erzielt wurden.

Schlussfolgerung: Der Methodenvergleich spiegelt die aktuelle Problematik in der Testosteronanalytik wider. So werden Messdifferenzen zu massenspektrometrischen Referenzmethoden auf eine mangelnde analytische Spezifität und Sensitivität, als auch ungenügende Validierung der Immunoassays zurückgeführt. Wenn niedrige Konzentrationen erwartet werden, wie bei der Testosteronanalyse in Serum von Frauen und Kindern, oder wenn zweifelhafte Analysenergebnisse vorliegen, sollte auf massenspektrometrische Referenzmethoden zurückgegriffen werden.