Regulation of gene expression and adhesion in Saccharomyces cerevisiae
Regulation der Genexpression und Adhäsion in Saccharomyces cerevisiae
by Malte Kleinschmidt
Date of Examination:2005-11-03
Date of issue:2005-11-16
Advisor:Prof. Dr. Gerhard Braus
Referee:Prof. Dr. Gerhard Braus
Referee:Prof. Dr. Wolfgang Liebl
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Format:PDF
Description:Dissertation
Abstract
English
Adherence represents one important and initial virulence factor of fungal pathogenicity. In the model fungus Saccharomyces cerevisiae adherence to substrates or to other cells depends on nutrients and is part of complex developmental processes, such as haploid invasive growth or diploid pseudohyphal formation. Adherence per se can also be induced by amino acid starvation. This specific adaptation requires the adhesin Flo11p and the transcriptional activator of the general amino acid control system Gcn4p. A genome-wide transcriptional analysis of ∑1278b yeast cells under adhesion-inducing conditions imposed by amino acid starvation was performed to identify specifically regulated genes. 22 novel genes were inducible by amino acid starvation. 72 genes of different functional groups showed a previously unrecognized dependence upon Gcn4p under adhesion-inducing conditions. In addition, several genes were identified as inducible by amino acid starvation in a Gcn4p-independent manner. 2D-DIGE experiments of ∑1278b yeast cells were carried out to identify regulated proteins under adhesion-inducing conditions. Seven protein spots displayed a highly increased intensity in response to amino acid starvation. These protein spots were identified by mass spectrometry as Cpc2p, Efb1p, His1p, Hsp60p, Sod1p, Tpi1p and Tpm1p. Comparisons with the respective transcriptional profiles revealed that the mRNA levels of the encoding genes were significantly increased only for the HIS1 gene. Deletion of CPC2, which encodes a highly conserved G?-like WD-repeat protein, results in an adhesion deficient phenotype of amino acid-starved yeast cells. CPC2 is also required for basal expression and activation of FLO11 under amino acid starvation. The adherence-dependent developmental processes of haploid invasive growth and diploid pseudohyphal formation also depend on CPC2. During utilization of the fermentable carbon source glucose, transcription of CPC2 is induced. CPC2 promoter analyses were performed to analyse regulation, and identified two upstream activation sequence elements required for basal expression and regulation of CPC2. The forkhead-like transcription factor Fhl1p and its co-factor Ifh1p were found as trans-acting elements. Deletion of FHL1 reduces CPC2 transcription significantly in presence of glucose, whereas increased amounts of Ifh1p induces CPC2 transcription even under utilization of the non-fermentable carbon source ethanol.
Keywords: yeast; <i>Saccharomyces cerevisiae</i>; adhesion; transcriptome; Gcn4; Cpc2
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Adhäsion stellt einen wichtigen Faktor bei der Virulenz pathogener Pilze dar. In dem Modellorganismus Saccharomyces cerevisiae ist die Adhäsion an Substraten oder an anderen Zellen abhängig vom Nährstoffangebot und Bestandteil komplexer Entwicklungsprozesse, wie dem haploiden invasiven Wachstum oder der Bildung von Pseudohyphen diploider Zellen. Adhäsion per se kann auch durch einen Mangel an Aminosäuren induziert werden. Diese spezifische Adaption benötigt das Adhäsin Flo11p und den Transkriptionsaktivator der Allgemeinen Kontrolle der Aminosäurebiosynthese` Gcn4p. Um spezifisch regulierte Gene zu identifizieren, wurde Adhäsion durch Aminosäuremangel induziert und eine genomweite Transkriptionsanalyse von ∑1278b Hefezellen durchgeführt. 22 neue Gene waren durch Aminosäuremangel induzierbar. 72 Gene aus verschiedenen funktionellen Gruppen zeigten eine bisher nicht bekannte Abhängigkeit von Gcn4p unter zur Adhäsion führenden Bedingungen. Zusätzlich wurden zahlreiche Gene identifiziert, die durch Aminosäuremangel Gcn4p-unabhängig induziert werden. Um regulierte Proteine unter zur Adhäsion führenden Bedingungen zu identifizieren, wurden 2-D-DIGE-Experimente mit ∑1278b Hefezellen durchgeführt. Sieben Proteinpunkte zeigten eine stark erhöhte Intensität unter Aminosäuremangel. Diese Proteinpunkte wurden durch Massenspektrometrie als Cpc2p, Efb1p, His1p, Hsp60p, Sod1p, Tpi1p und Tpm1p identifiziert. Ein Vergleich mit den entsprechenden Transkriptom-Daten ergab, dass unter Aminosäuremangel nur die mRNA Menge des HIS1-Gens signifikant erhöht ist. In Hefezellen führt eine Deletion des CPC2-Gens, welches für ein hoch konserviertes G?-artiges WD-Protein kodiert, zu einem Verlust der Adhäsion bei mangelhafter Versorgung mit Aminosäuren. Ein funktionales CPC2-Gen wird auch für die basale Expression von FLO11 und dessen Aktivierung unter Aminosäuremangel benötigt. Die adhäsionsabhängigen Entwicklungsprozesse des haploiden invasiven und diploiden Pseudohyphen-Wachstums sind ebenfalls abhängig von CPC2. Bei Verwertung der fermentierbaren Kohlenstoffquelle Glukose kommt es zur Induktion der CPC2-Transkription. CPC2-Promotoranalysen wurden durchgeführt, um diese Regulation zu untersuchen. Dabei wurden zwei stromaufwärts liegende Aktivierungselemente identifiziert, die für die basale Expression und Regulation von CPC2 benötigt werden. Der Forkhead`-artige Transkriptionsfaktor Fhl1p und sein Co-Faktor Ifh1p wurden als trans-agierende Elemente identifiziert. Ein Verlust von FHL1 verringert die CPC2 Transkription signifikant in Anwesenheit von Glukose, während erhöhte Mengen von Ifh1p auch bei Verwertung der nicht-fermentierbaren Kohlenstoffquelle Ethanol die CPC2-Transkription induzieren.
Schlagwörter: Hefe; <i>Saccharomyces cerevisiae</i>; Adhäsion; Transkriptom; Gcn4; Cpc2