Expression and functional analysis of <i>Tex18</i> and <i>Stra8</i> genes in male germ cells

Abstract

Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Expression und der funktionellen Analyse der beiden Testis- spezifischen Gene Tex18 und Stra8. Die RT- PCR- Expressionsanalyse des Gens Tex18 zeigte eine Expression ausschließlich in männlichen Keimzellen. Außerdem konnte die Expression von Tex18 in Entwicklungsmutanten (mit Ausnahme von W/WV- Mäusen, welche keine Keimzellen besitzen) sowie in prenatalen und postnatalen Stadien nachgewiesen werden. Auch ES- Zellen exprimieren Tex18. Für weitere Expressionsanalysen wurden transgene Mäuse generiert, welche EGFP unter der Kontrolle des 1,6 kb- Promotors von Tex18 exprimieren. Anhand von histologischen Testis- Schnitten konnte eine Tex18- Expression hauptsächlich in postmeiotischen Keimzellen detektiert werden. Eine FACS- Analyse mit testikulärer Zellsuspension dieser Tiere unterstützte diese Daten: Ein erhöhter Prozentsatz von EGFP- positiven Zellen konnte im Fall von älteren im Vergleich zu jüngeren Tieren beobachtet werden, bei welchen bereits mehr postmeiotische Zellen zu erwarten waren. Es konnte außerdem gezeigt werden, dass FACS- positive Zellen der transgenen Tiere im Vergleich zur WT- Kontrolle eine erhöhte Rate an haploiden Zellen beinhalten. Für funktionelle Analysen wurden KnockOut- Mäuse mit den Hintergründen C57 Bl/6J x 129/Sv und 129/Sv generiert. Männliche Tiere des ersten Hintergrunds waren fertil, aber 1/3 der Männchen mit dem 129/Sv- Hintergrund waren vollständig infertil, während die anderen 2/3 der Männchen eine reduzierte Fertilität zeigten. Obwohl die Anzahl der Spermien in der Cauda epididymis im Vergleich zur WT- Kontrolle nicht reduziert war, zeigten beide Hintergründe bei VP- Tests eine reduzierte Anzahl an Spermien im Uterus und im Ovidukt. Reduzierte Motilität und unnatürliche Bewegung der Spermien konnte bei beiden Hintergründen im Vergleich zur WT- Kontrolle festgestellt werden. Eine erhöhte Anzahl von Spermien mit abnormer Kopfstruktur wurde in der Cauda epididymis gefunden. Obwohl aber die Acrosomenstruktur in diesen Spermien verändert war, war ihre Funktion bei der Untersuchung der Acrosomenreaktion normal. Histologische Testis- Schnitte von homozygoten Männchen ließen Abnormalitäten in den Tubuli seminiferi vermuten. Die Effizienz der Spermatogenese war gestört und sehr oft zeigte sich ein Arrest im Stadium der runden Spermatiden. Apoptotische Spermatocyten und Spermatiden sowie diploide Spermatiden wurden in vielen Tubuli gefunden. Zusammenfassend lässt sich anhand dieser Daten sagen, dass Tex18 in die Spermatid- Differenzierung involviert ist und die Bildung von Asthenoteratozoospermien scheint der Grund für die Infertilität von Tex18- defizienten Mäusen zu sein.Ähnlich wie im Fall von Tex18 zeigten RT- PCR- Analysen, dass die Expression von Stra8 auf Keimzellen beschränkt ist. Stra8- Expression konnte ebenfalls in Entwicklungsmutanten (Ausnahme: W/WV- Mäuse) sowie in prenatalen und postnatalen Stadien detektiert werden. Immunohistochemische Untersuchungen mit einem Stra8- spezifischen Antikörper zeigten, dass die Expression des Gens auf die premeiotischen Stadien der Spermatogenese beschränkt ist, da das spezifische Signal nur in Zellen in unmittelbarer Nähe der Basalmembran der Tubuli seminiferi lokalisiert war. Dasselbe Muster zeigten histologische Testis- Schnitte von transgenen Mäusen, bei denen EGFP unter der Kontrolle des 1,4 kb- Promotors von Stra8 exprimiert wird. Expression von humanem Stra8 wurde auch ausschließlich im Testis nachgewiesen. Außerdem wurde gezeigt, dass die Expression von Stra8 in mit Retinsäure induzierten Tera1- Zellen (embryonales, humanes Teratokarzinom) ansteigt. Für funktionelle Analysen wurde eine KnockOut- Strategie entwickelt, in welcher die Exone 2 bis 8 (von insgesamt 9) ausgeschaltet wurden. Fünf Chimären konnten erhalten werden. Eine weibliche und zwei männliche Chimären haben das KnochOut- Konstrukt nicht an ihre Nachkommen weitergegeben. Zwei weitere 5%ige Chimären- Männchen waren infertil. Stammspezifische PCR- Analysen zeigten, dass im Sperma eines Tieres das ausgeschaltete Gen enthalten war. Histologische Testis- Schnitte dieses Männchens zeigten fortgeschrittene Degenerationen der Testis- Struktur und einen Arrest der Spermatogenese in allen Tubuli seminiferi. Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass Stra8 für die meiotische Differenzierung von Bedeutung sein könnte.