Charakterisierung von funktionellen Oberflächenstrukturen des Hepatitis-B-Virus Nukleokapsids
Characterization of functional surfaces of the hepatitis B virus nucleocapsid
by Alexander Pairan
Date of Examination:2005-11-03
Date of issue:2005-12-28
Advisor:PD Dr. Volker Bruss
Referee:Prof. Dr. Wolfgang Liebl
Referee:Prof. Dr. Detlef Doenecke
Referee:Prof. Dr. Martin Oppermann
Persistent Address:
http://dx.doi.org/10.53846/goediss-15
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Description:Dissertation
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Abstract
English
During hepatitis B virus (HBV) morphogenesis the transmembrane large envelope protein (L protein) probably directly interacts with mature cytosolic nucleocapsids. The shell of the capsid is formed by the core protein. To determine the role of single amino acid (aa) residues of the core protein during this process six (S17, L95, K96, F122, I126, and R127) and four surface exposed positions (S21, D22, N90, and R98) where alanine substitutions blocked envelopment or were wild type (wt), respectively, were substituted with several aa residues. The core mutants were phenotyped for capsid formation, genome maturation, and envelopment. Positions S17, L95, K96, and I126 came out to play an important role: 24 out of 28 mutants allowed assembly of mature nucleocapsids but blocked the envelopment (c+/v-). Positions S21, N90, and R98 on the other hand tolerated several different aa residues nearly without any loss of virion formation (c+/v+). Mutations at positions R127 and D22 showed different phenotypes, whereas mutants at position F122 mostly blocked proper capsid formation (c-/v-). Six mutants failing to produce mature, genomic DNA containing capsids, formed nucleocapsids containing the viral RNA pregenome, indicating a blocked reverse transcription. This suggests a complex contribution of the capsid shell in reverse transcription. Based on the results of the first part of the thesis stable Huh7 cell lines were established constitutively expressing the viral polymerase as well as the wt core protein or the core mutant I126A, respectively. The envelope proteins were provided in trans by transduction of recombinant MuLV-retroviruses containing an encapsidation-competent but replication-negative HBV genome. Productive transcomplementation and subsequent secretion of virus-like-particles were monitored by PCR. By means of this system the verification of a direct interaction between the L protein and the core proteins should be possible by screening for L protein mutants releasing the envelopment block caused by the core mutant I126A.
Keywords: hepatitis B virus; HBV; nucleocapsid; core protein; capsid envelopment; protein protein interaction
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Während der Morphogenese des Hepatitis-B-Virus (HBV) geht das transmembrane große Hüllprotein (L-Protein) wahrscheinlich eine direkte Interaktion mit reifen zytosolischen Nukleokapsiden ein, deren Schale aus dem Coreprotein aufgebaut ist. Um die Beteiligung einzelner Aminosäuren (AS) des Coreproteins hierbei zu bestimmen, wurden sechs (S17, L95, K96, F122, I126 und R127) und vier oberflächenexponierte Positionen (S21, D22, N90 und R98), bei denen eine Alanin-Substitution die Umhüllung blockierte bzw. nicht beeinflusste, mit verschiedenen AS-Resten substituiert. Die Core-Mutanten wurden in Hinblick auf die Kapsidbildung, Genomreifung und Umhüllungskompetenz phänotypisiert. Die Positionen S17, L95, K96 und I126 spielten eine essentielle Rolle während des Umhüllungsprozesses: 24 von 28 Mutanten erlaubten die Assemblierung von reifen Nukleokapsiden, blockierten aber deren Umhüllung (K+/V-). Die drei Positionen S21, N90 und R98 tolerierten hingegen unterschiedliche AS-Reste weitgehend ohne Verlust an Assemblierungsfähigkeit (K+/V+). Mutationen der Positionen R127 und D22 zeigten keinen einheitlichen Phänotyp. Die Mutanten der Position F122 blockierten zumeist die Kapsidformation (K-/V-). Sechs Mutanten, die keine DNA-Genom-haltigen Kapside bilden konnten, formten Kapside, die virales RNA-Prägenom enthielten, was auf eine blockierte reverse Transkription schließen lässt. Dies deutet auf eine komplexe Beteiligung der Kapsidschale bei der reversen Transkription hin. Aufbauend auf den Ergebnissen des ersten Teils wurden stabile HuH7-Zelllinien etabliert, die konstitutiv die virale Polymerase und das Wildtyp (WT) Coreprotein bzw. die I126A Mutante des Coreproteins exprimierten. Ein mittels Transduktion von rekombinanten MuLV-Retroviren in die Zellen eingebrachtes verpackungskompetentes aber replikationsdefizientes HBV-Genom stellte die Hüllproteine zur Verfügung. Die erfolgreiche Transkomplementierung, d.h. Sekretion von virusähnlichen Partikeln, konnte durch PCR nachgewiesen werden. Mit diesem System sollte der Nachweis einer direkten L-Protein-Kapsid Interaktion möglich sein, indem nach einer L-Mutante gesucht wird, die den Umhüllungsblock der I126A Core-Mutante aufhebt.
Schlagwörter: Hepatitis-B-Virus; HBV; Nukleokapsid; Core-Protein; Kapsidumhüllung; Protein-Protein-Interaktion
