Analysis of the Role of Piwil2 gene in Tumorigenesis and Germline Stem Cell Metabolisms

Abstract

Die Gene der piwi Familie werden durch ihre konservierte PAZ und Piwi Domäne charakterisiert und spielen eine wichtige Rolle bei der Stammzellselbsterneuerung , dem RNA silencing und der Translationsregulation in verschiedenen Organismen. Murine und humane Piwil2 Gene, Mitglieder der piwi Genfamilie, werden spezifisch im Testis expremiert. Wir berichten hier über eine gesteigerte Expression des humanen Piwil2 Gens in testikulären Seminomen, aber nicht in anderen testikulären Tumoren. Expression des Piwil2 Gens wurde auch in verschiedenen anderen Tumoren gefunden, wie in humanen Tumoren der Prostata, der Brust, des Gastrointestinaltrakts, der Ovarien und des Endometriums, sowie in murinen Brusttumoren, Rhabdomyosarkomen und Medulloblastomen. Aus diesem Grund wird Piwil2 als ein neues Krebs/Testis Antigen bezeichnet. Um Gene, die durch Piwil2 aktiviert werden, zu identifizieren, wurde ein Cancer gene array durchgeführt. Hierbei wurde RNA aus NIH3T3 Zellen isoliert und mit RNA aus NIH3T3 Zellen, die Piwil2 konstitutiv expremieren, verglichen. Ein erhöhtes Expressionslevel des Antiapoptosegens Bcl-XL konnte in Piwil2 expremierenden Zellen detektiert werden.Außerdem korrelierte die erhöhte Bcl-XL Expression mit einer erhöhten Expression des Stat3 Gens (signal transducer and activator of transcription 3). Gen silencing von Piwil2 mit der siRNA (small interference RNA) unterdrückte die Stat3 und Bcl-XL Expression und induzierte Apoptose. Eine ursächliche Verbindung zwischen Piwil2 Expression, Inhibition der Apoptose und gesteigerter Proliferation konnte in Piwil2 expremierenden Zellen gezeigt werden. Auch deuten die Ergebnisse eines Weichagar-Assays auf eine durch Piwil2 Überexpression induzierte Transformation von Fibroblasten hin. Zusammenfassend zeigen unsere Ergebnisse, dass Piwil2 in verschiedenen Tumoren expremiert wird und als ein Onkogen wirkt, indem es Apoptose inhibiert und die Proliferation durch den Stat3/Bcl-XL Signaltransduktionsweg fördert. Der Nachweis der Expression von Piwil2 könnte ein wichtiger Faktor für die Prognose, die Diagnostik und die Entwicklung einer Therapie einer großen Anzahl von Tumoren sein.In dieser Studie sollten mögliche Funktionen von Piwil2 in vivo analysiert werden. Dazu wurde eine transgene Maus generiert, die Piwil2 unter dem Testis-spezifischen human elongation factor-1α (EF-1α) Promotor expremiert. Homozygote transgene Mäuse sind lebensfähig, haben eine normale Körpergröße und zeigen keine physischen Auffälligkeiten. Homozygote Männchen sind subfertil, sie haben kleinere Testis als Wildtyp-Kontrollen. Die beobachtete verringerte Spermienzahl ist auf degenerierte Spermatozyten zurückzuführen. Die Spermatogenese in transgenen Mäusen scheint bis zu den runden Spermatiden normal, ab dem Stadium der runden Spermatiden erfolgt ein Arrest der Entwicklung. Dieser entsteht nicht durch massive Apoptose, allerdings entsteht der Arrest in einigen Tubuli früher als in anderen. Es wurden Klumpen von Zellen beobachtet, von denen einige ( auch einzelne Zellen ) apoptotisch waren. Keimzellen scheinen in loser Formation nahe des Lumens zu liegen, viele verschwanden über das Lumen. Vermutlich lassen sich runde Spermatiden in den Nebenhoden der Mäuse nachweisen. Bei histologischen Analysen und einem TUNEL Assay zeigte sich eine verstärkte Apoptoserate im Vergleich zum Wildtyp. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass ein kompletter Arrest im Stadium der runden Spermatiden beobachtet wurde.Piwil2, auch als Mili bekannt, ist eines der drei Homologen von Piwi in der Maus. Piwil2 wurde in Keimzellen im adulten Testis gefunden. Dies deutet auf eine Funktion bei der Spermatogonialen Stammzellselbsterneuerung hin . Um die molekularen Mechanismen der Stammzellaktivität durch Piwil2 zu untersuchen, wurde ein in vitro gain of function Zellkulturmodel entwickelt. mRNA aus Piwil2 expremierenden und nicht expremierenden Zellen wurde mit Hilfe eines Stammzell-Arrays verglichen. Es konnte gezeigt werden, dass piwil2 die Expression von stammzellspezifischen Genen beeinflußt. Dazu gehören Pdgfrb (Platelet derived growth factor receptor, beta polypeptide), Slc2a1 (Solute carrier family 2 member1), Gja7 (Gap junction membrane channel protein alpha 7) und die spermatogonialen Zelloberflächenmarker Thy-1 (CD90), Itga6 (Integrin alpha 6), CD9 und die spermatogonialen Marker Hsp90α (Heat shock protein 90 alpha) und Stra8 (Stimulated by retinoic acid gene 8). Diese Moleküle spielen eine essentielle Rolle bei der Stammzellproliferation (Pdgfrb), dem Zellmetabolismus (Slc2a1), der Zelladhäsion, der Zell-Zell-Interaktion (Itga6, Gja7, Thy-1 und CD9) und der Keimzelldifferenzierung (Stra8). Die Expression dieser Marker in spermatogonialen und anderen Stammzellen deutet darauf hin, dass diese Zellen molekulare Mechanismen mit Stammzellen anderer Gewebe, die durch Piwil2 reguliert werden, gemeinsam haben.