Isolierung und Charakterisierung der gamma-Tocopherolmeth yltransferase

Abstract

Bei den Tocopherolen und Tocotrienolen handelt es sich um niedermolekulare Antioxidantien, die in der Lage sind, Singulett-Sauerstoff direkt aus der Membranumgebung zu entfernen, indem sie als Radikalfänger fungieren. In der Medizin wird Vitamin E gegen Krankheiten wie Krebs und Alzheimer eingesetzt. Die Tocopherole werden ausschließlich von photosynthetisch aktiven Organismen gebildet, wie z.B. Höhere Pflanzen, Grünalgen und Cyanobacterien. In Algen und in der Fruchtschale von Paprika werden relativ hohe Tocopherolmengen gefunden. Photoautotroph ohne Kohlenstoffquelle gewachsene Algenzellen von Chlorella und Chlamydomonas erreichen alpha-Tocopherol in Konzentration von über 50 bzw. 200 µg pro g Trockengewicht. In der Fruchtschale von reifen roten Paprikafrüchten vom Markt steigt die alpha-Tocopherolkonzentration parallel zur Akkumulation von sekundären Carotinoiden und Triacylglyceriden an und erreicht Werte von bis zu 200 µg pro g Trockengewicht. Gleichzeitig mit dem Anstieg des alpha-Tocopherolgehaltes steigt auch die gamma-Tocopherolmethyltransferase Aktivität. Die Eigenschaften der gamma-Tocopherolmethyltransferase (gamma-TMT) von dem partiell gereinigten Enzym aus roten Paprikafrüchten und dem rekombinanten Enzym aus Arabidopsis wurden mit einander verglichen. Die Molekülmasse von beiden Enzymen wurde mit ungefähr 36 kDa bestimmt. Das pH-Optimum liegt für das Paprikaenzym bei pH 7,5 und für Arabidopsis bei pH 8,5. Die Temperaturmaxima sind im Rahmen der Meßgenauigkeit vergleichbar (33°C für Arabidopsis und 35°C für Paprika). Beide Enzyme wandeln delta- bzw. gamma-Tocopherol in beta- bzw. alpha-Tocopherol um. Beta-Tocopherol bzw. Tocotrienol wird nicht als Substrat akzeptiert. Daraus kann man schließen, dass die Methylierung spezifisch in der C(5)-Position am aromatischem Ring stattfindet. Die Km-Werte von beiden Enzymquellen sind für die untersuchten Vitamin E-Derivate nahezu identisch. Nur die Enzympräparation aus Paprika besitzt die zusätzliche Fähigkeit delta- bzw. gamma-Tocotrienol in beta- bzw. alpha-Tocotrienol umzuwandeln. Die Zwei-Substrat-Reaktion der gamma-TMT gehorcht einem Iso-ordered Bi Bi Mechanismus. Manipulationen der gamma-TMT-Reaktion mit Hilfe von Antisensepflanzen haben keinen Einfluß auf den Gesamt-Tocopherolgehalt, was den Schluß nahe legt, dass die gamma-TMT keine Schlüsselfunktion in der Tocopherolbiosynthese aufweist.