Interaktion von Leukozyten mit endothelialen Adhäsionsmolekülen und ihre Inhibition durch Expression von konkurrierenden Fusionsproteinen

Abstract

Die Adhäsion von Monozyten an das vaskuläre Endothel und ihre Rekrutierung in die Gefäßwand führen unter chronischen Bedingungen zu pathologischen Veränderungen, die einer Therapie bedürfen. Bei den genannten Prozessen übernimmt das vaskuläre Zelladhäsionsmolekül-1 (VCAM-1; CD106) eine besondere Rolle, da es sowohl an der Adhäsion als auch an der Transmigration von Monozyten beteiligt ist. Von besonderem Interesse ist seine Funktion bei dem chronisch entzündlichen Phänomen der Atherosklerose, weshalb die vorliegende Arbeit versuchte, die Funktion von VCAM-1 näher aufzuklären und darüber hinaus einen gentherapeutischen Ansatz zur gezielten Blockade des Rezeptors zu entwickeln. Zu diesem Zweck wurde der Oberflächenrezeptor zunächst stabil in eine immortale Zelllinie transfiziert. Die Beteiligung von VCAM-1 an den genannten Vorgängen konnte in diesem Modell erbracht, und mit Hilfe der gezielten Blockade des Rezptors mit anti-VCAM-1 spezifiziert werden. Des weiteren wurde durch Cytochalasin D Behandlung nachgewiesen, dass VCAM-1 eine Verankerung im Actinskelett brauchte, um seine Aufgaben erfüllen zu können, da andernfalls der prozentuale Anteil von adhärenten oder transmigrierten Monozyten signifikant zurückging. Eine funktionelle Blockade von VCAM-1 ließe sich demnach eventuell dadurch erzielen, indem dem Rezeptor die Bindung an das Zytoskelett verhindert / blockiert wird. Um dies näher zu untersuchen, wurde ein Fusionsmolekül (CD7/VCAM) entwickelt, das sich aus der intrazellulären Domäne des nativen Rezeptors und transmembranären bzw. extrazellulären Anteilen des inerten Markers CD7 zusammensetzte. cd7/vcam wurde zusätzlich stabil in die VCAM-1 exprimierenden Zellen transfiziert und diese daraufhin erneut Funktionsanalysen unterzogen. Doppelt transgene Zellen zeigten gegenüber den Kontrollansätzen einen signifikanten Rückgang von rekrutierten Monozyten, so dass CD7/VCAM erfolgreich mit VCAM-1 um dessen Bindungsstellen zum Zytoskelett konkurrierte und eine funktionelle Inhibition erzielte. Um Wechselwirkungen mit anderen Oberflächenrezeptoren ausschließen zu können, wurden die Untersuchungen auf Analysen an transgenen Zelllinien erweitert, welche die endothelialen Oberflächenrezeptoren E-Selektin (CD62E) und ICAM-1 (CD54) exprimierten, da diese im Zusammenspiel mit VCAM-1 zu der Rekrutierung von Leukozyten beitragen. Darüber hinaus wurden weiterführende Analysen am humanen endothelialen Zellmodell (HUVECs) durchgeführt. Die Zellen wurden hierzu auf ihre Wechselwirkung mit Monozyten untersucht und die Befunde der unstimulierten (nicht-inflammatorisch) und stimulierten (inflammatorisch) Versuchsansätze verglichen, ebenso erfolgten Funktionsanalysen an Zellen mit transfiziertem cd7/vcam. Die Expression des Fusionsproteins erzielte unter inflammatorischen Bedingungen auch in diesem Modell einen deutlichen Rückgang von rekrutierten Monozyten. Eine Weiterentwicklung dieses gentherapeutischen Ansatzes zur Bekämpfung chronisch entzündlicher Prozesse erscheint daher durchaus sinnvoll.