Elektroporation: Eine Methode zur Transfektion von Wirbeltierembryonen

Abstract

Die Änderung des entwicklungsbiologischen Potentials einer Zelle und damit auch die Veränderung ihres Schicksals während der Embryogenese des Vertebratenembryos kann durch gezielte Überexpression morphoregulatorisch wirkender Proteine erreicht werden. Neben viralen Gentransfersystemen bieten sich aufgrund ihrer leichten Handhabung verschiedene auf physikalischen Prinzipien basierende Methoden, wie Lipofektion, Beschuß mit Mikropartikeln sowie die Elektroporation zur Einführung nackter DNA in Gewebestrukturen des Embryos an. Im Rahmen dieser Arbeit wurden verschiedene experimentelle Ansätze etabliert und verfeinert, um mit Hilfe der Elektroporation Gene in verschiedenen Stadien des Hühnerembryos, angefangen vom Beginn der Gastrulation bis hin zum Abschluß der Neurulation überzuexprimieren. Zur Analyse der veränderten Genexpressionsprofile wurde ein abgeändertes Verfahren der In-situ-Hybridisierung, basierend auf PCR generierten Matrizen entwickelt. Durch die Möglichkeit, ektopisch transiente Genexpressionen auch in frühen murinen Entwicklungsstadien zu erziele! n, bietet sich nun die Perspektive, dies zusammen mit der in der Maus etablierten genetischen Manipulationsmöglichkeiten, wie Genverlustmutationen, als kombinat ori-schen Ansatz zur Untersuchung entwicklungsbiologischer Vorgänge einzusetzen. Der zweite Teil der Arbeit beschäftigt sich mit den Musterbildungsprozessen während der Ausbildung der Neuralplatte im Hühnerembryo. Es wurde mit Hilfe von Über-expressionsstudien die Rolle von Geminin, BMP4 und DlX5 in den Muster-bildungsprozessen, die zur Anlage der Neuralplatte und zur Segregation von neuralen und epidermalen Identitäten im Ektoderm führen, untersucht. Es konnte gezeigt werden, daß ektopisch exprimiertes BMP4, ein TGF-o Faktor in der Lage ist, in allen drei Keimblättern den epidermalen Marker MSX1 auf transkriptioneller und transla-tioneller Ebene anzuschalten. Die Überexpression von Geminin führte zur Transkription des Homeoboxgens MSX1 jedoch nicht zu der Umsetzung der MSX1 RNA in eine funktionelle Peptidsequenz. Das durch den epidermalen Marker BMP4 induzierbare Homeoboxgen DLX5 ist in der Lage, die Expression von BMP4 ektopisch in allen transgenen Zellen zu induzieren und könnte daher Teil einer positiven Rückkopplungs-schleife sein. Alle drei untersuchten Faktoren führen zur Expression von Genen, die an der Grenze zwischen neuralem und epidermalen Ektoderm aktiv sind und tragen insofern zur Etablierung epidermaler, nicht jedoch neuraler Identitäten bei..