Characterization of alternative NADH dehydrogenases in the respiratory chain of Toxoplasma gondii as a novel drug targets

Abstract

Das singuläre Mitochondrium der schnell replizierenden Tachyzoiten von Toxoplasma gondii generiert ein Membranpotential, über dessen Beitrag zum Energiestoffwechsel des Bradyzoiten- oder Ruhestadiums des Parasiten bisher wenig bekannt ist.Die steady state mRNA-Konzentration von 11 nukleär-kodierten Enzymen der Atmungskette wurde durch quantitative Real-Time RT-PCR in Tachyzoiten und Bradyzoiten untersucht. Dabei ließ sich nach Normalisierung mit ß-tubulin kein signifikanter Unterschied hinsichtlich der Transkriptmenge in beiden Stadien feststellen. Für Expressionsversuche wurden die offenen Leserahmen der folgenden Gene des Energiemetabolismus bestimmt und mit Hilfe der RT-PCR überprüft: (i) Alternative NADH Dehydrogenase I und II; (ii) die Flavoprotein Untereinheit der Succinat-Dehydrogenase; (iii) Cytochrom c1; und (iv) die ß-Untereinheit der ATP-Synthase. Diese Gene zeigen höchste Übereinstimmungen zu Orthologen in Plasmodium. Sie sind single-copy, nukleär-kodierte Gene, deren offene Leserahmen von multiplen Introns unterbrochen werden und N-terminale mitochondriale targeting-Sequenzen aufweisen. Die offenen Leserahmen der fünf Gene wurde mit einem C-terminalen Myc-Tag fusioniert und unter Kontrolle eines Tetracyclin-regulierbaren Promoters gebracht. Nach stabiler Transfektion der Plasmidkonstrukte in die TATi-1-Zelllinie von T. gondii und entsprechenden Kolokalisationsstudien, konnte gezeigt werden, dass die kodierten Proteine exprimiert und korrekt in das Mitochondrium transportiert werden. Die Expression und Lokalisation von TgNDH2-I und TgATP-ß wurde durch den Einsatz von Mausantiserum bestätigt, das durch Immunisation mit dem jeweiligen rekombinantem Protein gewonnen worden war. Die Überexpression dieser Proteine zeigt keinen Einfluß auf die Wachstumsrate der Parasiten.Das Genom von T. gondii enthält die typischen Komponenten der Atmungskette. Ein Komplex I (NADH:Q reductase) fehlt jedoch. An seiner Stelle konnten zwei Isoformen einer single-subunit, nicht-protonenpumpenden Alternativen NADH Dehydrogenase, TgNDH2-I und TgNDH2-II identifiziert werden. Die DNA-Sequenzen umfassen 2793 und 7686 Basenpaare und enthalten offene Leserahmen mit einer Länge von 1875 und 1974 Basenpaaren. Die beiden Gene kodieren für Präkursor-Polypeptide mit 618 bzw. 657 Aminosäuren und einem errechneten Molekulargewicht (MW) von 67 bzw. 72 kDa. Dabei zeigen die offenen Leserahmen der Isoformen eine 58 %ige Übereinstimmung der Nukleotidsequenz; ihre Genprodukte zeigen eine 43 %ige Übereinstimmung auf Aminosäureniveau. Die Tatsache, dass die Alternativen (Typ II) NADH Dehydrogenasen von T. gondii und P. falciparum in Säugetierzellen fehlen, macht sie zu einem vielversprechenden Angriffspunkt antimikrobieller Therapie. Die Chinolon-ähnliche Verbindung 1-hydroxy-2-dodecyl-4(1)quinolone (HDQ) wurde vor kurzem als hoch-affiner Inhibitor Alternativer NADH Dehydrogenasen in Pilzen beschrieben. Die Hemmung durch HDQ konnte in enzymatischen Assays gezeigt werden, wobei der Inhibitor wahrscheinlich mit der Ubiquinol Bindungsstelle des Enzyms interferiert. In dieser Studie konnte in Zellkulturversuchen die Inhibition der Replikation von T. gondii dargestellt werden. Die IC50 wurde mit zwei unabhängigen Wachstumsassays bestimmt und lag zwischen ~2-8 nM. Ein besonderes Merkmal der HDQ-Struktur ist die Länge der Alkyl-Seitenkette an Position 2. Derivate mit den Alkylseitenketten C6, C8, C12 (HDQ) und C14 zeigten hervorragende anti-T. gondii Aktivität, während das C5-Derivat keine replikationshemmende Wirkung aufwies. Aufgrund ihrer strukturellen Ähnlichkeit ist davon auszugehen, dass 1-hydroxy-2-alkyl-4(1)quinolone mit Ubiquinonen um die selbe Bindungsstelle an der Alternativen NADH Dehydrogenase kompetitieren. In Anwesenheit von HDQ kam es in T. gondii-infizierten Kulturen zur Induktion des Bradyzoitenstadiums. Dieses Phänomen ist durch den Einsatz anderer Replikationsinhibitoren von T. gondii, die ebenfalls zur Induktion bradyzoitspezifischer Gene führen, gut bekannt. Die Kombinationsbehandlung T. gondii-infizierter Wirtszellen mit HDQ und dem Malariamittel Atovaquon, das die Ubiquinol-Oxidationsstelle von Cytochrom b in Komplex III blockiert, resultierte in einem starken synergistischen Effekt. Der Angriff zweier unterschiedlicher Orte innerhalb des mitochondrialen Ubiquinon/Ubiquinol-Zyklus erscheint somit als höchst effektive Strategie der Wachstumshemmung der Parasiten. HDQ und seine Derivate sind somit, besonders in Kombination mit Atovaquon, vielversprechende Verbindungen mit großem Potential für die Therapie der Malaria und der Toxoplasmose.Die endogenen Gene der Atmungskette sollten mit Hilfe der homologen Rekombination durch zusätzliche regulierbare Gen-Kopien ersetzt werden, um auf diese Weise induzierbare knock-out Mutanten zu generieren. Depletion von TgNDH2-I in einer konditionalen knock-out Mutante hat weder Einfluß auf die Replikationsrate noch auf die in vitro Stadienkonversion der Parasiten. Daraus läßt sich der Schluß ziehen, dass TgNDH2-II allein für die intrazelluläre Entwicklung ausreicht. Gleichzeitig konnte jedoch eine geringfügige Hochregulierung der steady state mRNA-Konzentration von TgNDH2-II in der knock-out Mutante im Vergleich zum Wildtyp festgestellt werden. Außerdem konnte gezeigt werden, dass TgNDH2-I depletierte Parasiten eine stark erhöhte Suszeptibilität gegenüber HDQ aufweisen: 1 nM HDQ genügte für die komplette Hemmung des Parasitenwachstums. Somit läßt sich spekulieren, dass die Über-Expression der zweiten Isoform, nämlich TgNDH2-II den Verlust von TgNDH2-I kompensiert.