Transition of intrinsically unfolded α-synuclein into the fibrillar state characterized by NMR spectroscopy

Abstract

Proteine falten in eine geeignete Konfiguration, die sog. native Struktur, um ihre zelluläre Funktion zu erhalten. Eine nicht-native Struktur verursacht Fehlfunktionen des Proteins und ruft entsprechende Erkrankungen hervor. Solche Fehlfaltungen wurden als gemeinsamer pathogener Prozess in vielen neurodegenerativen Erkrankungen wie der Alzheimer- und der Parkinson-Krankheit entdeckt. Bei der Parkinson-Krankheit (PK) findet man das Protein α-Synuclein (αS) als Hauptkomponente der Lewy Bodies, proteinreicher Aggregate, die durch die Amyloidfibrillenform des αS gebildet werden. Unter Berücksichtigung des Charakters eines intrinsisch entfalteten Proteins ist die Strukturänderung während der PK sehr interessant für Biophysiker, die ein Verständnis von Proteinfaltung und fehlfaltung erlangen wollen, und detaillierte Informationen können therapeutische Erfolge bei der Behandlung der PK liefern.In dieser Arbeit ist der Übergang des intrinsisch entfalteten αS zu Amyloidfibrillen mithilfe von NMR-Spektroskopie und biophysikalischen Methoden untersucht worden. Nativ entfaltete Proteine spielen eine Schlüsselrolle in normalen und pathologischen Prozessen. Wenn man nativ entfaltete Proteine wie αS in schwach orientierenden Medien untersucht, zeigen sich überraschend variable NMR dipolare Kopplungen als Funktion der Position entlang der Aminosäurekette, was auf die Existenz von partieller Sekundär- oder Tertiärstruktur hinweist. In Kapitel 3 ist gezeigt, dass die Variation der NMR dipolaren Kopplungen und heteronuklearen Relaxationsraten in αS mit der Variation der Sperrigkeit der Aminosäure entlang der Polypeptidkette korreliert. Die Ergebnisse zeigen, dass die Sperrigkeit der Aminosäuren die lokale Konformation und Dynamik von αS und anderen nativ entfalteten Proteinen bestimmt. Abweichungen von der Random-Coil-Struktur können Aufschluss über restliche Sekundärstruktur und transiente langreichweitige Tertiärkontakte in entfalteten Proteinen geben. Der Übergang von einer nativ entfalteten Konformation zu Amyloidfibrillen beginnt mit einer Veränderung der Monomerstruktur. Wie bereits zuvor gezeigt wurde, nimmt αS unter physiologischen Bedingungen eine auto-inhibitorische Konformation ein. Änderungen der Umgebung wie niedriger pH-Wert, Zugabe von molecular crowding -Substanzen, hohe Temperatur und/oder hohe Salzkonzentrationen beschleunigen die Aggregation von αS. Unter diesen Bedingungen kann sich αS in ein leicht aggregierendes, partiell entfaltetes Intermediat transformieren. Solche Veränderungen wurden bei einem pH-Wert von 3 mithilfe von CD, SAXS und Fluoreszenz beobachtet. Wie in Kapitel 4 beschrieben, wurde NMR-Spektroskopie verwendet, um solche Konformationsänderungen mit atomarer Auflösung zu untersuchen. Kapitel 5 beschreibt die Untersuchung des Amyloidfibrillenkerns des Wildtyps (wt) im Vergleich zu der genetischen Mutante A30P. Es wurde dabei der Vorteil der HR-MAS NMR-Spektroskopie ausgenutzt, flexible Regionen in Amyloidfibrillen detektieren zu können. Zusammen mit Wasserstoff/Deuterium-Austauschexperimenten (H/D-Austausch) konnte die Anordnung von -Strängen und Schleifen im Fibrillenkern gezeigt werden. Im Vergleich zu wt-Fibrillen wurden für A30P längere Kernregionen der Amyloidfibrillen gefunden. Kapitel 6 enthält eine kurze Beschreibung der Konformation von αS-Oligomeren, die aus Amyloidfibrillen in unterkühlter wässriger Lösung erhalten wurden. Elektronenmikroskopie und Atomkraftspektroskopie (AFM) enthüllen eine kugelförmige Struktur mit Variationen in Durchmesser und Höhe. Diese Arbeit wird in Kombination mit physiologischen Untersuchungen zu einem besseren Verständnis der Intermediate der Amyloidfibrillenbildung führen.