Fettsäuretransport in die peroxisomale Matrix von <i>Arabidopsis thaliana</i>

Abstract

Fettsäuren sind essentielle Bestandteile lebender Organismen. Aufgrund der sehr geringen Wasserlöslichkeit ist der Verteilungsvorgang von Fettsäuren zwischen Zellen, als auch innerhalb einer Zelle sehr komplex. Insbesondere der Transport von Fettsäuren durch Membranen wird seit vielen Jahren erforscht, ohne dass bislang allgemein gültige Prinzipien beschrieben wurden. In dieser Arbeit wurde speziell der Transport von Fettsäuren durch die peroxisomale Membran untersucht. Der Fettsäuretransport in Peroxisomen ist eine wichtige Vorraussetzung für den Abbau von Speicherlipiden während der Keimung von Ölsaaten. In Arabidopsis thaliana ist für diesen Transport die Funktion des peroxisomalen ABC-Transporters PXA1 essentiell. Als Substrat dieses Transporters wird in Anlehnung an die Situation in Saccharomyces cerevisiae eine aktivierte Fettsäure in Form von Acyl-CoA postuliert. Andererseits sind für die weitere Metabolisierung durch ß-Oxidation die beiden peroxisomalen Acyl-CoA-Synthetasen LACS6 bzw. LACS7 notwendig. Der Transport der mit CoA aktivierten Fettsäure in die Peroxisomen und die dennoch erforderliche Aktivierung mit CoA innerhalb der Peroxisomen erscheint als Widerspruch und stellt den Ausgangspunkt der in der vorliegenden Arbeit durchgeführten Untersuchungen dar. In A. thaliana konnte durch die Erzeugung einer Dreifachmutante lacs6 lacs7 pxa gezeigt werden, dass sowohl die Ausgangsmutanten lacs6 lacs7 und pxa1-2 als auch die lacs6 lacs7 pxa-Dreifachmutante noch zu einem stark verlangsamten Abbau der Speicherlipid-spezifischen Eicosensäure (20:1) befähigt sind. Aus diesem Befund wurde geschlossen, dass es sich bei dem Transporter PXA1 und den peroxisomalen LACS um aufeinander folgende Komponenten eines Stoffwechselweges handelt. Der verzögerte Abbau der Triacylglyceride wird auf einen ß-Oxidations-unabhängigen Prozess zurückgeführt, wobei die α-Oxidation als alternativer Abbauweg ausgeschlossen werden konnte. Durch Bestimmung des Acyl-CoA-Pools der Mutanten war erkennbar, dass besonders sehr langkettige aktivierte Fettsäuren während der Keimlingsentwicklung akkumulierten. Die verstärkte Elongation der Fettsäuren wird als Ursache für den stark verlangsamten Abbau der Speicherlipide angenommen. Die sehr langkettigen aktivierten Fettsäuren könnten Ausgangssubstrate für die Wachssynthese bzw. für die Bildung von Sphingolipden sein. Mittels RT-PCR wurde die Expression der neun LACS-Gene während der Keimung und frühen Keimlingsentwicklung überprüft. Die Transkripte der beiden peroxisomalen LACS waren bereits während der Keimung nachweisbar. Zum Zeitpunkt des Triacylglycerid-Abbaus waren jedoch auch zytoplasmatische LACS exprimiert, so dass eine Aktivierung von Fettsäuren im Zytosol prinzipiell möglich ist. Das Substrat für den PXA1-Transporter könnte demnach sowohl die freie als auch die aktivierte Fettsäure sein. Promotoranalysen von PXA1 und LACS7 zeigten während der gesamten Entwicklung in fast allen Geweben eine weitestgehend übereinstimmende Aktivität. Die beobachteten Unterschiede in der Promotoraktivität von PXA1 und LACS7 deuten jedoch daraufhin, dass beide Proteine auch in voneinander unabhängigen Stoffwechselwegen arbeiten. Diese Expressionsanalyse unterstreicht die wichtigen Funktionen von PXA1 und LACS7 auch über die Keimlingsentwicklung hinaus. Die Untersuchung der Keimungsfähigkeit von verschiedenen PXA1-Transportermutanten zeigte, dass das Brechen der Samenruhe in Gegenwart von Zucker nicht wie ursprünglich angenommen von der Lage der Mutation innerhalb des Gens abhängt, sondern von Faktoren bestimmt wird, die auf die Integrität der Samenschale wirken. Für die Bestimmung der Substratspezifität des PXA1-Transporters wurden intakte Glyoxysomen aus Ricinus communis für Transportversuche eingesetzt. Diese Versuche erbrachten Hinweise, dass freie bzw. aktivierte langkettige Fettsäuren von den Glyoxysomen aufgenommen werden. Hierbei konnte jedoch bisher keine eindeutige bevorzugte Aufnahme eines der beiden Substrate festgestellt werden. Zur weiteren Charakterisierung des peroxisomalen PXA1-Transporters wurde an einer Methode zur funktionellen Rekonstitution in künstlichen Lipidvesikeln (Liposomen) gearbeitet. Dazu wurde zunächst PXA1 in Saccharomyces cerevisiae überexprimiert und anschließend die Gesamtmembranen isoliert. Mit Hilfe von Detergenz wurden Proteine aus den Membranen gelöst und für eine Rekonstitution in Liposomen eingesetzt. In den Transportversuchen mit Proteoliposomen konnte bisher kein PXA1-abhängiger Fettsäuretransport beobachtet werden. In Vorversuchen konnte gezeigt werden, dass die Membran von Liposomen ohne Proteineinlagerungen per se für langkettige Acyl-CoA-Ester undurchlässig ist. Freie langkettige Fettsäuren werden hingegen zu einem großen Teil unspezifisch transportiert bzw. in der Membran gebunden. Dieser unspezifische Transport konnte durch vorausgehende Komplexierung der Fettsäuren mit BSA herabgesetzt werden. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass Liposomen, welche mit einer Acyl-CoA-Synthetase vorbeladen wurden, den Transport von freien langkettigen Fettsäuren durch die Membran begünstigen. Demnach ist für den Transport von freien Fettsäuren per se kein Transportprotein notwendig. Es ist darüber hinaus zu vermuten, dass eine direkte Protein-Protein-Interaktion zwischen PXA1 und den peroxisomalen LACS nicht notwendig ist. In Saccharomyces cerevisiae wird der dem pflanzlichen PXA1 homologe ABC-Transporter durch die beiden Gene PAT1 und PAT2 kodiert. Darüber hinaus sind in der Hefe die zwei peroxisomalen Acyl-CoA-Synthetasen Faa2p und Fat2p bekannt. Für Fat2p konnte jedoch bisher keine enzymatische Aktivität nachgewiesen werden. In Wachstumsversuchen auf Ölsäure-haltigem Medium sollte überprüft werden, ob das pflanzliche PXA1 in der Lage ist, den Verlust von PAT1 zu komplementieren. Dazu wurden zunächst die Mutanten pat1∆ und pat1∆ faa2∆ erzeugt und mit einem PXA1-tragenden Expressions-Plasmid transformiert. Eine Komplementierung konnte jedoch nicht gezeigt werden. Weitere Untersuchungen in der Hefe zeigten, dass eine Deletion des FAT2-Gens in Kombination mit einer PAT1- bzw. FAA2-Deletion für das Wachstum der Zellen auf Ölsäure-haltigem Medium letal ist. Aufgrund dieser beiden synthetisch letalen Phänotypen und ersten Enzymtests wird vermutet, dass es sich bei Fat2p um eine Acyl-CoA-Synthetase mit zumindest schwacher Aktivität handelt, die im bisherigen Fettsäureimportmodell nicht berücksichtigt wurde. Es wird postuliert, dass die Aktivität der Fettsäureaktivierung in den Peroxisomen von Saccharomyces cerevisiae im Gegensatz zur bisherigen Sichtweise möglicherweise ebenso essentiell ist, wie die der peroxisomalen LACS-Proteine in Arabidopsis thaliana.