Characterisation of the cell wall protein Pga29p in the human pathogenic fungus <i>Candida albicans</i>

Abstract

Candida albicans ist ein opportunistischer humanpathogener Pilz, der für die meisten Candida-Infektionen beim Menschen verantwortlich ist. Er kann oberflächliche Infektionen auf der Schleimhaut, den Nägeln oder der Haut verursachen. In immuno-defizienten Einzelpersonen kann sich C. albicans über den Blutstrom verbreiten und invasiv Gewebe infizieren, was zu lebensbedrohenden Situationen führen kann. Um die Behandlung von C. albicans Infektionen zu verbessern, ist ein vollständiges Verständnis der Pathogenese auf einem molekularen Niveau erforderlich. In den letzten zwei Dekaden war die Zellwand von C. albicans ein zentrales Thema der Pilz-Forschung, hauptsächlich weil diese essentielle Struktur nicht in Säugetierzellen vorkommt und dadurch ein mögliches Ziel zur Antimykotikaentwicklung darstellt. Außerdem besteht die obere Schicht der Zellwand aus Mannoproteinen, die eine wichtige Rolle im Infektionsprozeß von C. albicans spielen. In der vorgelegten Arbeit charakterisieren wir Pga29p (Predicted GPI-anchored protein 29), ein kleines Hefe-spezifisches Protein, das kovalent an dem beta-1,3-Glukanskelett über beta-1,6-Glukan mit der Zellwand verbunden wird. Das Protein ist in der Wand der Hefezellen reichlich anwesend, aber die kovalente Einbindung nimmt bei dem Hefe-zu-Hyphe Übergang stark ab. Die Deletion von PGA29 induziert keine Änderungen im Chitin oder in dem Proteinniveau der Zellwand. Jedoch ist das Mannose/Glukose Verhältnis signifikant reduziert. Dies deutet darauf hin, dass der Mannangehalt in den Zellwänden der pga29/pga29 Mutante vermindert ist. Der pga29/pga29 Stamm zeigte dagegen keine Unterschiede im Wachstum, der Empfindlichkeit gegenüber Zellwandstress und gegen diverse Antimykotika im Vergleich mit den Kontrollestämmen. Mit dem Ziel kompensatorische Veränderungen in der Mutante aufzuzeigen, wurde das ganze Zellwandproteom der pga29/pga29 Deletionsmutante mittels Flüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC/MS/MS) analysiert. Die resultierenden Daten deuten an, dass die Deletion von PGA29 nicht durch einen verstärkten Einbau der Homologen Pga30p und Pga31p oder anderer Zellwandproteine (CWPs) kompensiert wird. Pga29p scheint daher keine tragende Rolle für die Zellwandintegrität von C. albicans zu spielen. In zwei unabhängigen Virulenzmodellen, einem Mäusemodell für systemische Infektion und einem humanen oralen Epithel Modell (RHE), zeigte die pga29/pga29 Mutante eine reduzierte Virulenz auf. Die nachgewiesene Herabregulation von PGA29 während des Hefe-zu-Hyphe Übergangs legt daher nahe, dass das Protein am Anfang des Infektionsprozesses beteiligt ist. Jedoch konnte gezeigt werden, dass die verminderte Virulenz nicht mit einer geänderten Adhäsionskapazität oder einer verringerten Fähigkeit Hyphen zu bilden korreliert ist. Da die Zellwandmannane wichtige pathogen associated molecular patterns (PAMPs) darstellen, wurden weitere Experimente ausgeführt, um die Frage zu beantworten, ob das verringerte Mannan in der pga29/pga29 Mutante für geänderte Wirtszelleinteraktionen verantwortlich sein könnte. Eine O-Mannosylierung von Pga29p durch die Protein-O-mannosyltransferase 1 (Pmt1p) wurde durch Analyse von CWP-Extrakten von C. albicans Mutanten, die defizient sind in ihrer O-Glykosylierung, nachgewiesen. RHE, welches mit dem pga29/pga29 Stamm infiziert wurde, zeigte eine verringerte Expression von pro-inflammatorischen Zytokinen. Diese verminderte Immunantwort könnte mit der Abnahme des Mannans in der Zellwand zusammenhängen. Ein anderes Erklärungsmodell der veränderten Immunantwort wäre der verringerte Gewebeschaden der durch die pga29/pga29 Mutante verursacht wird. Jedoch zeigten primäre dendritische Zellen (mDCs), die aus der Maus isoliert wurden und auch menschliche polymorphonukleare Leukozyten (PMNs) keine geänderten Zytokinmuster oder veränderte Niveaus des oxidativen Bursts nach Stimulierung mit der pga29/pga29 Mutante. Die beobachtete verringerte Virulenz der Mutante scheint daher nicht mit einem geänderten Wirts-Pathogen cross talk basierende auf der Reduktion der Mannane zusammenzuhängen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass Pga29p im Anfangsstadium der Infektion (noch vor der Hyphenentwicklung) beteiligt ist ist und damit das erste Hefe-spezifische CWP von C. albicans darstellt welches eine direkte Rolle in der Virulenz spielt.