Untersuchung der Spezifität von Antiterminationsproteinen in Bacillus subtilis
Analysis of the specificity of antiterminator proteins in Bacillus subtilis
by Sebastian Hübner
Date of Examination:2008-10-28
Date of issue:2009-02-20
Advisor:Prof. Dr. Jörg Stülke
Referee:Prof. Dr. Jörg Stülke
Referee:PD Dr. Michael Hoppert
Persistent Address:
http://dx.doi.org/10.53846/goediss-323
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Description:Dissertation
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Abstract
English
Regulatory systems often evolve by duplication of ancestral systems and subsequent specialization of the components of the novel signal transduction systems. In the Gram-positive bacterium Bacillus subtilis, four homologous antitermination systems control the expression of genes involved in the metabolism of glucose, sucrose and â-glucosides. Each of these systems is made up of a sensory sugar permease that also acts as phosphotransferase, an antitermination protein and a RNA switch that is composed of two mutually exclusive structures, a RNA antiterminator (RAT) and a transcriptional terminator. We have identified the essential bases in the different RAT structures that are responsible for keeping the signalling straight. Here we analysed the differences between the antitermination proteins. Since the amino acids that are involved in RNA binding are basically the same in all antitermination proteins we decided to randomly alter the sequence of the RNA-binding domain (RBD) of SacT and to screen for mutants capable of binding RAT structures normally recognized by LicT. We found that the exchange of Pro-26 to Ser completely switched the specificity of the RBD. Interestingly, positions 26 and 31 take part in RNA binding but are less conserved and not crucial. Pro-26 and Gln-31 were subjected to random mutagenesis. The mutated RBDs that were isolated during this screen showed that a change of Pro-26 to Arg, Ser or Cys is sufficient for a switch in specificity of SacT RBD. Mutations of Gln-31 to basic amino acids seem to enhance the RNA binding. Furthermore, the specificity of the interaction of the PTS components with the antiterminator proteins should be analysed. Therefore, the structures of the complexes should be solved. The complete PTS was reconstructed in vitro. We were able to show that even the isolated PRDs are still phosphorylated. Furthermore, a perfectly symmetric RAT structure was constructed for crystallography. It was shown that this RAT is still recognized by GlcT effectively in vivo and in vitro.
Keywords: Bacillus subtilis; antitermination; RNA switch; PTS
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Bacillus subtilis kann eine Vielzahl verschiedener Kohlenstoffquellen aufnehmen und verwerten. Damit B. subtilis keinen Nachteil gegenüber anderen Bakterien hat, muss zuerst die Kohlenstoffquelle verwertet werden, die die meiste Energie liefert. Damit diese Hierarchie der Kohlenstoffquellen erhalten bleibt , muss die Aufnahme strikt reguliert werden. Die Zucker Glukose, Salicin und Saccharose werden durch das sogenannte Phosphotransferase-System aufgenommen. Die Expression der Permeasen wird durch Antitermination reguliert. Ein Antiterminationsprotein bindet hierbei an die sogenannte RAT-Struktur der mRNA der jeweiligen Permease und verhindert so die Termination der Transkription. Die Regulation der Aktivität dieser Antiterminationsproteine erfolgt über Phosphorylierung durch PTS-Proteine. Das allgemeine PTS-Protein HPr aktiviert die Antiterminationsproteine, während die Phosphorylierung durch die zuckerspezifischen Permeasen zur Inaktivierung führt. Die Phosphorylierungen erfolgen an konservierten Histidinen. Um die Spezifität der Protein-Protein-Interaktion zu untersuchen, sollten die Strukturen der Komplexe der Antiterminationsproteinen mit den Phosphodonoren geklärt werden. Dafür wurden in dieser Arbeit das komplette PTS in vitro rekonstruiert. Die Phosphorylierung der isolierten Domänen konnte gezeigt werden. Für die Untersuchung der Struktur von GlcT im Komplex mit der ptsG-mRNA wurde eine RAT-Struktur entwickelt, die aus nur 10 Basen besteht und mit sich selber paaren kann. Es konnte sowohl in vivo als auch in vitro gezeigt werden, dass diese RNA ausreicht um von GlcT gebunden zu werden. Außerdem wurde in dieser Arbeit die Spezifität dieser Antiterminationsproteine auf der Ebene der RNA-Bindung untersucht. Das Protein SacT bindet die mRNA der Saccharose-Permease SacP. SacT wurde in dieser Arbeit mutiert, um Varianten zu isolieren, die andere RAT-Strukturen binden können. Ein einziger Aminosäureaustausch reicht aus, um die Spezifität der RNA-bindenden Domäne zu verändern. Wird das Prolin 26 in ein Serin getauscht, bindet dieses Antiterminationsprotein alle RAT-Strukturen in B. subtilis. Durch diesen Aminosäurenaustausch geht die Spezifität verloren. Durch weitere Mutagenese der Positionen 26 und 31 konnten weitere Varianten isoliert werden, die ebenfalls alle unspezifisch RAT-Strukturen binden können. Dabei wurden besonders häufig Varianten isoliert, bei denen das Prolin gegen geladene Aminosäuren ausgetauscht wurde.
Schlagwörter: Bacillus subtilis; antitermination; RNA Schalter; PTS