Untersuchung, Entwicklung und Anwendung reversibel schaltbarer fluoreszierender Proteine

Abstract

Fluoreszierende Proteine sind innerhalb des letzten Jahrzehnts zu einem essentiellen Bestandteil der biologischen Forschung geworden. Seit ihrer Entdeckung als Marker für Proteine in lebenden Zellen wurden FPs mit unterschiedlichen Eigenschaften in nahezu allen Farben des sichtbaren Spektrums entwickelt. Eine neue Unterklasse der fluoreszierenden Proteine kann reversibel mit Licht von einem fluoreszierenden in einen nicht fluoreszierenden Zustand geschaltet werden. Diese reversibel schaltbaren fluoreszierenden Proteine (RSFPs) haben aufgrund dieser einzigartigen Eigenschaft großes Potential in der Anwendung und Entwicklung neuer lichtmikroskopischer Methoden. In dieser Doktorarbeit wurde der molekulare Mechanismus der reversibel schaltbaren fluoreszierenden Proteine in den Grundlagen aufgeklärt, neue RSFPs mit verbesserten Eigenschaften wurden generiert und in verschiedenen Mikroskopietechniken eingesetzt. Für die Untersuchung des Schaltens auf molekularer Ebene wurden die Proteine kristallisiert und im Kristall vollständig in den fluoreszierenden und nicht fluoreszierenden Zustand geschaltet, um dessen strukturelle Unterschiede zu bestimmen. Durch die Analyse beider zu diesem Zeitpunkt bekannten RSFPs, asFP595 und Dronpa, konnte eine cis-trans-Isomerie des Chromophors als grundlegender Mechanismus für das reversible Schalten identifiziert werden. Die Isomerisierung führt zu einer Änderung der Umgebung des Chromophors, so dass die beiden Zustände unterschiedliche Absorptions- und Fluoreszenzeigenschaften aufweisen. Diese haben ihre Ursache in der Protonierung und Stabilisierung des Chromophors, welche als entscheidende Eigenschaften für das reversible Schalten identifiziert wurden. Aufgrund dieser Ergebnisse war es möglich, ein vereinfachtes Modell des Schaltens aufzustellen, das für alle derzeit bekannten RSFPs gültig ist. Der Aufbau eines Test- und Auswahlverfahrens ermöglichte die gezielte Modifikation der Eigenschaften von RSFPs. Durch gerichtete und zufällige Mutagenese wurden die verbesserten reversibel schaltbaren fluoreszierenden Proteine rsFastLime, bsDronpa, Padron und Padron* entwickelt. Unter Verwendung der Proteine rsFastLime und bsDronpa konnte hochauflösende Mikroskopie in Zellen mit einer Auflösung jenseits der Beugungsgrenze gezeigt werden. Zusätzlich wurde mit den neu generierten Proteinen eine Methode entwickelt, die eine aberrationsfreie Aufnahme mehrerer fluoreszierender Proteine in einer Zelle erlaubt, die monochromatische Mehrfarben-Mikroskopie. Das Verständnis des Schaltmechanismus, die in dieser Arbeit generierten RSFPs und deren Anwendung erweitern die Möglichkeiten zur Erforschung lebender Zellen.