Biochemische Charakterisierung von PpoA aus Aspergillus nidulans

Abstract

In der vorliegenden Arbeit wurden Psi-Faktor produzierende Oxygenasen, sogenannte Ppo-Enzyme, charakterisiert, die eine regulatorische Funktion für die Entwicklung und Mycotoxinproduktion in A. nidulans besitzen. Bioinformatische Analysen zeigten, dass Ppo-Enzyme im N-terminalen Sequenzabschnitt eine hohe Homologie zu Fettsäure-Häm-Dioxygenasen/Peroxidasen aufweisen, während der C-terminale Sequenzabschnitt den Cytochrom-P450-Enzymen ähnelt. Um die biochemischen Eigenschaften von PpoA und PpoC zu untersuchen, wurde ein heterologes Expressionssystem in E. coli und ein Proteinreinigungsprotokoll etabliert. Während PpoA sich mit großen Proteinausbeuten stabil bis zur Homogenität reinigen ließ, war PpoC in gereinigter Form instabil und verlor die enzymatische Aktivität innerhalb weniger Minuten. PpoA wurde als homotetrameres Häm-Protein identifiziert, das die Oxidation von einfach und mehrfach ungesättigten Fettsäuren katalysiert. Auf der Basis von Aminosäuresequenzvergleichen, einem charakteristischen Häm-CO-Spektrum und ESR-Spektroskopie-Analysen konnte die Cytochrom-P450-Domäne nachgewiesen werden. Untersuchungen des Reaktionsmechanismus zeigten, dass PpoA zwei verschiedene Häm-bindende Domänen verwendet, um zwei voneinander getrennt ablaufende Reaktionen zu katalysieren. In der Fettsäure-Häm-Dioxygenase/Peroxidase-Domäne wird Linolsäure zu 8R-HPODE oxidiert, indem in einem initialen Reaktionsschritt ein Tyrosyl-Radikal gebildet wird, welches ein Wasserstoffatom vom C-8 der Fettsäure abspaltet. Es entsteht ein kohlenstoffzentriertes Radikal, welches im folgenden Schritt mit molekularem Sauerstoff reagiert und 8R-HPODE bildet. Das so intermediär gebildete Zwischenprodukt wird in der Cytochrom-P450-Domäne anschließend zu 5,8-DiHODE isomerisiert. Im Gegensatz zu PpoA scheint PpoC nur eine N-terminale Fettsäure-Häm-Dioxygenase/Peroxidase-Domäne zu besitzen und katalysierte hauptsächlich die Oxidation von Linolsäure zu 10-HPODE und die weitere Reduktion zu 10-HODE. Es konnte keine Isomerase-Aktivität nachgewiesen werden. Allerdings ist 10-HPODE instabil und wurde entweder zu 10-KODE oxidiert oder zerfiel zu 10-ODA und volatilen C8-Körpern, die unter anderem für den charakteristischen Pilzgeruch verantwortlich sind. Mutagenese-Studien wiesen darauf hin, dass PpoC wahrscheinlich einen ähnlichen Mechanismus für die Oxidation von Linolsäure verwendet wie PpoA und hierbei auch ein Tyrosyl-Radikal für die Abspaltung eines Wasserstoffatoms vom Fettsäurerückgrat gebildet wird. Es konnte gezeigt werden, dass die unterschiedlichen Positionen der Oxidation am Fettsäurerückgrat durch Aminosäurereste in der Fettsäure-Häm-Dioxygenase/Peroxidase-Domäne beeinflusst werden. Diese schirmen entweder das C-8 oder C-10 der Fettsäure vor dem Angriff von molekularem Sauerstof sterisch ab.