Charakterisierung der endosomalen Qb-SNAREs Vti1a und Vti1b

Abstract

SNARE-Proteine spielen als Vermittler der Membranfusion eine wichtige Rolle im intrazellulären Membrantransport. Diese Arbeit wurde angefertigt um mehr über den Mechanismus des Transports innerhalb der Zelle heraus-zufinden und Proteine zu charakterisieren, die im endosomalen und lysosomalen Transport eine Rolle spielen. Dabei wurden die endosomalen Qb-SNARE-Proteine Vti1a und Vti1b näher untersucht. Mittels Immunopräzipitationen konnte nachgewiesen werden, dass Vti1a zusammen mit Syntaxin 6 (Qc), Syntaxin16 (Qa) und VAMP4 (R) einen Komplex bildet. Vti1a-defiziente Mäuse sind lebensfähig und fertil. Untersuchungen der Aktivitäten von lysosomalen Enzymen in Geweben von Vti1a-defizienten Tieren ergaben normale Werte, was auf eine Kompensation der Vti1a-Defizienz deutet. Proteinmengen von untersuchten SNAREs waren in Vti1a-defizienten Geweben nicht beeinträchtigt, was jedoch eine mögliche Kompensierung der Vti1a-Defizienz durch diese Proteine nicht ausschließen kann. Außerdem wurde gezeigt, dass Syntaxin 8 (Qc) in Vti1b-defizienten Zellen in Lysosomen degradiert wird. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass Vti1b entweder für die Stabilität des Syntaxin 8 benötigt wird oder eine Fehlsortierung in das Lysosom verhindert. Die Menge des Qc-SNAREs Syntaxin 6 ist in Vti1a-defizienten Zellen nicht beeinträchtigt, was darauf hinweist, dass Syntaxin 6 eventuell noch eine andere Funktion ausübt. Ein Endosomenfusionsassay für Maus-embryonale Fibroblasten wurde etabliert. Die Fusionsfähigkeit von späten Endosomen von Vti1b-defizienten Zellen ist ein weiterer Hinweis darauf, dass andere SNAREs das Fehlen von Vti1b kompensieren. Internalisierungsassays haben gezeigt, dass der Transport von pinozytierten oder Rezeptor-vermittelt endozytierten Markern in lysosomale Kompartimente in Vti1a-defizienten Zellen beschleunigt und in Endobrevin/Vti1b-doppeldefizienten Zellen verlangsamt ist. Die Beschleunigung des Transports in Vti1a-defizienten Zellen sowie die beobachtete Umverteilung von Vti1b in Vti1a-defizienten Zellen spricht für eine Kompensierung der Vti1a-Defizienz mit Vti1b. Auch ein Defekt im retrograden Transport von den frühen Endosomen zum TGN könnte der Grund für die Umverteilung sein. Der langsamere Transport von endozytierten Markern in Endobrevin/Vti1b-doppeldefizienten Zellen spricht gegen eine Kompensation der Vti1b-Defizienz durch einen komplett anderen SNARE-Komplex. Eine Umverteilung von MPR46 in Vti1a/Vti1b-doppeldefizienten Zellen konnte beobachtet werden und ist vielleicht mit einem Defekt im retrograden Transport vom frühen Endosom zum TGN verknüpft.