Mass Spectrometric Analyses of Post-Translationally Modified Proteins

Hsiao, He-Hsuan

dc.contributor.advisor	Urlaub, Henning Dr.	de
dc.contributor.author	Hsiao, He-Hsuan	de
dc.date.accessioned	2012-04-16T14:54:17Z	de
dc.date.available	2013-01-30T23:50:37Z	de
dc.date.issued	2011-01-05	de
dc.identifier.uri	http://hdl.handle.net/11858/00-1735-0000-0006-ADDD-D	de
dc.identifier.uri	http://dx.doi.org/10.53846/goediss-415
dc.description.abstract	Post-translationalen Modifikationen (PTMs) von Proteinen werden Schlüsselfunktionen für die Regulierung verschiedener zellulärer Prozesse zugeschrieben. In der vorliegenden Arbeit wurden verschiedene neue Methoden zur Identifizierung von PTMs, insbesondere von Phosphorylierungen, Glykosylierungen und SUMOylierungen, entwickelt. Die Arbeit behandelt fünf Themen: Kapitel 1 (General Introduction) erläutert den Begriff Proteomik und die Wichtigkeit der PTMs von Proteinen. Außerdem werden die wichtigsten Methoden der Proteomanalyse, einschließlich der Prinzipien der Protein- und Peptidtrennung, sowie die Theorie der Massenspektrometrie (MS) und das Konzept der Proteom-Datenanalyse erläutert. In Kapitel 2 (A High-Throughput Method for Phosphopeptide Enrichment of Spliceosomal Proteins and Its Application) wird eine Hochdurchsatz-Methode zur Anreicherung von Phophopeptiden spleißosomaler Proteine unter Verwendung einer selbsthergestellten Einweg-TiO2-Mikrospin-Säule beschrieben. Die vorgestellte Methode bietet verschiedene Vorteile wie den Hochdurchsatz, die leichte Anwendung, niedrige Kosten, hohe Selektivität und Sensitivität. In Kombination mit verschiedenen Proteomstrategien wurden 1381 einzigartige Phosphorylierungsstellen zugehörend zu 390 individuellen spleißosomalen Proteinen identifiziert. Ferner wurde diese Methode angewendet um Phosphorylierungsstellen der Proteine PRP6, PRP31 und SLP65 zu untersuchen und Protein-RNA-Interaktionen nach der UV-induzierten Quervernetzung zu erforschen. Kapitel 3 ( Efficient Enrichment of Intact Phosphoproteins prior to Mass Spectrometric Analysis ) befasst sich mit einem zielgerichteten und verlässlichen Verfahren der Phosphoprotein-Anreicherung, welches auf der Kalziumphosphat-Präzipitation (CPP) basiert. Durch Einbindung der TiO2-Mikrospin-Säule wurden insgesamt 192 einzigartige Phosphorylierungsstellen zugehörend zu 45 individuellen Proteinen des U1 snRNPs (small nuclear ribonucleoprotein particles) identifiziert. Von diesen waren 59 Phosphorylierungsstellen bisher unbekannt. Kapitel 4 (Pseudo-Neutral-Loss Scan for Selective Detection of Phosphopeptides and N-Glycopeptides using Liquid Chromatography Coupled with a Hybrid Linear Ion-Trap/Orbitrap Mass Spectrometer) beschreibt eine Pseudo-Neutralverlust-Analyse an einem Hybrid-LTQ-Orbitrap Massenspektrometer für die selektive Analyse von Phosphopeptiden und Glykopeptiden. Bei Anwesenheit bekannter, charakteristischer Massenpaare (Phosphorsäure oder Monosaccharid-Reste) im Massenspektrum während der kollisions-induzierten Dissoziation (colision induced decay, CID) wurde die Tandem-Massenspektrometrie (MS/MS) sowie die mehrstufig aktivierte Tandem-Massenspektrometrie (multi-stage activation MS3 fragmentation) eingeleitet. Diese Methode ist kompatibel mit der nano-Flüssigkeitschromatographie (nano-LC) für die Trennung komplexer Peptidmischungen und erfordert keine weitere Anreicherung. Die resultierenden Spektren liefern die Peptidsequenz und Modifizierungsstellen, sowie Informationen über die Glykanstruktur. Kapitel 5 ( ChopNSpice , a Mass Spectrometric Approach That Allows Identification of Endogenous Small Ubiquitin-like Modifier-conjugated Peptides) beschreibt ein neues, benutzerfreundliches und zielgerichtetes Serviceprogramm (genannt ChopNSpice ) für die Datenbanksuche um die SUMO1- und SUMO2/3-Konjugationsstellen von Säugetieren in vitro und in vivo mittels Massenspektrometrie in Kombination mit Suchmaschinen wie MASCOT oder Sequest eindeutig zu bestimmen. Die datenabhängige Aufnahme (data dependent acquisition, DDA) hoher Massen ist sehr geeignet für die genaue Detektion und Sequenzierung großer Peptide und erleichtert außerdem die Detektion niedrig-abundanter SUMO-Konjugate. Wir haben die Leistungsfähigkeit der ChopNSpice-Software in Kombination mit einer Proteomstudie gezeigt - mit dem Ergebnis der Identizierung von 10 SUMOylierten Proteinen in HeLa-S3-Zellen mit 17 eindeutigen Modifizierungsstellen. Von diesen waren 15 SUMOylierungsstellen bisher nicht bekannt und stellen nun eine nützliche Quelle für die biologische Forschungsgemeinschaft dar.	de
dc.format.mimetype	application/pdf	de
dc.language.iso	eng	de
dc.rights.uri	http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/	de
dc.title	Mass Spectrometric Analyses of Post-Translationally Modified Proteins	de
dc.type	doctoralThesis	de
dc.title.translated	Massenspektrometrische Analyse post-translational modifizierter Proteine	de
dc.contributor.referee	Ficner, Ralf Prof. Dr.	de
dc.date.examination	2010-08-09	de
dc.subject.dnb	500 Naturwissenschaften	de
dc.description.abstracteng	Protein post-translational modifications (PTMs) possess key functions in the regulation of various cellular processes. In this thesis, several new technologies are developed to map protein PTMs, containing phosphorylation, glycosylation and SUMOylation. Five major topics are presented in this thesis. In Chapter 1- General Introduction, describes what is proteomics, the importance of protein PTMs, the main techniques in proteomic analysis, including the principle of technologies for protein and peptide separation, the theory of mass spectrometry (MS) and concept of proteomic data analysis. In Chapter 2 - A High-Throughput Method for Phosphopeptide Enrichment of Spliceosomal Proteins and Its Application, a disposable TiO2 microspin column is fabricated in-house for enrichment of phosphopeptides. The method offers several advantages, including high-throughput, easy to use, low cost, high selectivity and sensitivity. In combination with different proteomic strategies, 1381 unique phosphorylation sites corresponding to 390 distinct proteins were identified in spliceosomal proteins. We further applied this method to explore the phosphorylation sites on PRP6, PRP31 and SLP65 and to study protein-RNA interaction by UV-induced crosslinking reaction. In Chapter 3 - Efficient Enrichment of Intact Phosphoproteins prior to Mass Spectrometric Analysis, a straightforward and reliable phosphoprotein purification procedure was developed based on calcium phosphate precipitation (CPP). Integration of TiO2 microspin column, a total of 192 unique phosphorylation sites corresponding to 45 distinct proteins were identified from the U1 small nuclear ribonucleoproteins (snRNPs); of these, 59 phosphorylation sites were not reported previously. In Chapter 4 - Pseudo-Neutral-Loss Scan for Selective Detection of Phosphopeptides and N-Glycopeptides using Liquid Chromatography Coupled with a Hybrid Linear Ion-Trap / Orbitrap Mass Spectrometer, a pseudo-neutral-loss scan on a hybrid LTQ-Orbitrap MS was built up for selectively probing phosphopeptides and glycopeptides. The presence of known characteristic mass pair (phosphoric acid or monosaccharide residues) in the spectrum during in-source collision-induced dissociation (CID) was selected to trigger MS/MS and multi-stage activation MS3 fragmentation. Our method is compatible with nano-liquid chromatography (nano-LC) for separation of complex peptide mixtures without any further enrichment. The consequent spectra provide peptide sequence identification and modified site assignment as well as information of the glycan structure. In Chapter 5 - ChopNSpice , a Mass Spectrometric Approach That Allows Identification of Endogenous Small Ubiquitin-like Modifier-conjugated Peptides, a novel, user-friendly and straightforward database search tool was developed, called ChopNSpice , to unambiguously determine the mammalian SUMO1 and SUMO2/3 conjugation sites in vitro and in vivo by mass spectrometry in combination with MS-based search engines like MASCOT or Sequest. High mass data dependent acquisition (DDA) is highly suitable for the accurate detection and sequencing of larger peptides and additionally facilitates detection of lower abundant SUMO-conjugates. We demonstrated the power of ChopNSpice software in combination with proteomic strategy, resulting in the identification of 10 SUMOylated proteins corresponding to 17 distinct sites in endogenous Hela-S3 cells. 15 SUMOylated sites were identified in this study appeared to be novel, which may provide a valuable resource to the biological research community.	de
dc.contributor.coReferee	Melchior, Frauke Prof. Dr.	de
dc.subject.topic	Biology (incl. Psychology)	de
dc.subject.ger	ChopNSpice	de
dc.subject.ger	Kalziumphosphat-Präzipitation (CPP)	de
dc.subject.ger	Glykosylierungen	de
dc.subject.ger	Massenspektrometrie (MS)	de
dc.subject.ger	Phosphorylierungen	de
dc.subject.ger	Post-translationalen Modifikationen (PTMs)	de
dc.subject.ger	Pseudo-Neutral-Loss Scan	de
dc.subject.ger	SUMOylierungen	de
dc.subject.eng	ChopNSpice	de
dc.subject.eng	Calcium Phosphate Precipitation (CPP)	de
dc.subject.eng	Glycosylation	de
dc.subject.eng	Mass Spectrometry (MS)	de
dc.subject.eng	Phosphorylation	de
dc.subject.eng	Post-Translational Modifications (PTMs)	de
dc.subject.eng	Pseudo-Neutral-Loss Scan	de
dc.subject.eng	SUMOylation	de
dc.subject.bk	58.3	de
dc.identifier.urn	urn:nbn:de:gbv:7-webdoc-2761-1	de
dc.identifier.purl	webdoc-2761	de
dc.affiliation.institute	Biologische Fakultät inkl. Psychologie	de
dc.subject.gokfull	WA 320: Spektroskopie {Biologie}	de
dc.subject.gokfull	WA 330: Chromatographie {Biologie}	de
dc.subject.gokfull	WA 340: Elektrophorese {Biologie}	de
dc.identifier.ppn	664238165	de

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Fakultät für Biologie und Psychologie (inkl. GAUSS) [1621]

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