Evolutive in vitro-Adaption eines thermostabilen, (βα)8-barrel-Proteins an die Katalyse einer abiotischen Reaktion

Abstract

Das tHisF, die Synthase-Untereinheit der Imidazolglyzerinphosphat-Synthase aus dem hyperthermophilen Organismus Thermothoga maritima, wurde verwendet, um den (βα)8-barrel-Faltungstyp für die Entwicklung von polypeptidischen Katalysatoren zugänglich zu machen. Basierend auf der Struktur des tHisF-Proteins wurde eine Bibliothek von synthetischen thisF-Genvarianten konstruiert, die an den Positionen, über die das Protein voraussichtlich mit einem Substrat interagiert, mit Hilfe von Trinukleotidmischungen partiell randomisiert worden waren. Diese Bibliothek wurde auf genetischer Ebene an ein Hüllprotein des filamentösen Phagen M13 fusioniert, so dass die jeweiligen Proteinvarianten auf dessen Oberfläche präsentiert werden konnten. Ein stabiles Strukturanalogon des Übergangszustandes einer 4-Nitrophenolester-Hydrolyse wurde synthetisiert. Mittels phage display konnten Phagen-Subpopulationen aus der Bibliothek angereichert werden, die in der Lage waren, an das immobilisierte Strukturanalogon zu binden. Es konnte gezeigt werden, dass diese polyklonalen Phagenmischungen Esterase-Aktivität aufwiesen. Aus ihnen konnten dann Einzelklone mit Esterase-Aktivität isoliert werden. Es konnte demnach gezeigt werden, dass es möglich ist, ein (βα)8-barrel-Protein an die Katalyse einer abiotischen Reaktion anzupassen.