Bedeutung der Homöodomäne des Transkriptionsfaktors Pax6 für die Aktivierung des Glukagon-Gens durch Pax6

Abstract

Pax6 ist einer der essentiellen Transkriptionsfaktoren zur Aktivierung der Glukagon-Genexpression und enthält zwei DNA-Bindungsdomänen, die Paired-Domäne und die Homöodomäne. In vitro bindet Pax6 über seine Paired-Domäne an das proximale Promotorelement G1 und an Domäne A des mehr distalen Promotorelements G3 des Glukagon-Promotors. Nicht bekannt war bisher, ob die Homöodomäne von Pax6 bei diesem Prozeß eine Rolle spielt. Diese Arbeit beschreibt Ergebnisse aus transienten Cotransfektionen in der heterologen Zelllinine JEG-3 und von Protein-DNA-Bindungsstudien sowie von weiteren Untersuchungen zur Bedeutung der Homöodomäne für die Aktivierung des Glukagon-Gens durch Pax6.Der Vergleich von transienten Cotransfektionen von Pax6-Wildtyp und von Pax6 mit Mutationen der Homöodomäne zeigt, dass die Pax6-Homöodomäne für die Aktivierung des Glukagon-Gens durch Pax6 von Bedeutung ist. Bindungsstudien mit mutiertem Pax6 belegen, dass die Pax6-Homöodomäne zur Bindung an das G1-Element nötig ist, zur Bindung an das G3-Element jedoch nicht. Bei der Aktivierung des Glukagon-Gens ist die Pax6-Homöodomäne sowohl an der Aktivierung über das G1- als auch über das G3-Element beteiligt. Somit ist die verminderte Aktivierung des Glukagon-Gens durch Pax6-Homöodomänen-Mutanten nicht auf eine verminderte Bindung von Pax6 an das G1-Element zurückzuführen. Die dazu durchgeführten Cotransfektionen mit Promotorkonstrukten mit deletiertem bzw. mit intern mutiertem G1- oder G3-Element belegen auch, dass die Pax6-Homöodomäne unabhängig vom Synergismus zwischen den beiden Pax6-Bindungsstellen in G1 und G3 des Glukagon-Promotors für die Aktivierung des Glukagon-Gens durch Pax6 bedeutsam ist. Bei transienten Cotransfektionen in heterologen JEG-3-Zellen und pankreatischen alpha-Zellen vermindert die Mutation der Domäne B des G3-Elements deutlich die Aktivierung des Glukagon-Gens durch Pax6, was auf eine Bedeutung der Domäne B bei der Glukagon-Genaktivierung hinweist. Die Mutation in Domäne B vermindert auch die Aktivierung des Glukagon-Promotors durch die Pax6-Homöodomänen-Mutanten. Daher scheint Domäne B des G3-Elements, unabhängig von der Pax6-Homöodomäne, für die Aktivierung des Glukagon-Gens durch Pax6 notwendig zu sein. Die Deletion der Pax6-Homöodomäne steigert die transkriptionelle Aktivität eines GAL4-Pax6-Fusionsproteins an einem Glukagon-Promotor-Reporterfusionsgen, in dem die Pax6-Bindungsstellen im G1- und G3-Element in Bindungsstellen für GAL4 mutiert sind, wie Cotransfektionsstudien zeigen. Demnach übt die Homöodomäne in diesem Fall eine inhibitorische Wirkung aus.Die Ergebnisse lassen sich in einem Modell zusamenfassen, das von komplexen Wechselwirkungen der Pax6-Homöodomäne mit anderen Pax6-Protein-Domänen und mit DNA-Sequenzen des Glukagon-Promotors ausgeht.