Entwicklung eines Fusionsassays basierend auf porenüberspannenden Membranen

Abstract

Die Fusion von Lipiddoppelschichten spielt eine essentielle Rolle in vielen biologischen Prozessen, weshalb die Aufklärung des genauen Mechanismus im Fokus vieler Forschungsarbeiten steht. Die Arbeiten an Modellmembransystemen haben dabei viel zu dem heutigen Wissensstand über die Membranfusion beigetragen. Dennoch sind einige Aspekte des Fusionsprozesses, wie zum Beispiel die genaue Wirkweise von fusogenen Peptiden und Proteinen, bis heute nicht aufgeklärt. Der Einsatz von porenüberspannenden Membranen als Basis für einen Fusionsassays, dessen Etablierung im Fokus dieser Arbeit stand, soll eine neue Möglichkeit eröffnen Limitierungen bestehender Untersuchungs-methoden zu überwinden. Die Untersuchungen zur Lipidvermischung zeigen, dass porenüberspannende Membranen geeignet sind, um Fusionsereignisse zu analysieren. Zunächst wurde die Ca2+-vermittelte Fusion von Vesikeln mit micro-black lipid membranes (micro-BLMs) untersucht. Der Einsatz von großen unilamellaren Vesikeln mit einem mittleren Durchmesser von 600 nm ermöglichte die Beobachtung von Einzelfusionsereignissen. Die porenüberspannende und die Vesikelmembran wurden mit den fluoreszenzmarkierten Lipiden Oregon Green DHPE und Texas Red DHPE dotiert. Auf diese Weise wurde die Lipidvermischung während der Fusion durch die Löschung der Oregon Green-Fluoreszenz, hervorgerufen durch den abstandsabhängigen Förster Resonanz Energie Transfer, indiziert. Der Einbau der Vesikellipide in die porenüberspannende Lipiddoppelschicht wurde zusätzlich durch die Diffusion der Texas Red DHPE-Moleküle in der planaren Membran bestätigt. Aus den Daten konnte für die Verteilung des roten Texas Red-Farbstoffs in micro-BLMs ein Diffusionskoeffizient von D = (9 ± 5) µm²/s bestimmt werden. Dieser Wert stimmt gut mit der Diffusionskonstante überein, die in früheren fluorescence recovery after photobleaching-Analysen ermittelt wurde. Durch die Fusion von Vesikeln wird zusätzliches Lipidmaterial in die porenüberspannenden Membranen eingebaut. Um zu untersuchen, ob und inwieweit dadurch die Membrantopologie im System verändert wird, wurden micro-BLMs vor und nach der Fusion von Vesikeln mit Hilfe der Rasterionenleitfähigkeitsmikroskopie abgebildet. Eine Analyse der erhaltenen Höhenprofile ließ den Schluss zu, dass das Einbringen von zusätzlichen Lipiden dazu führt, dass die porenüberspannenden Membranen sich tiefer in die Pore hineinwölben. Die chemisorbierten Thiolipide, die zur Funktionalisierung der goldbedeckten Porenstege eingesetzt wurden, scheinen eine Diffusionsbarriere für die untere Monolage der porenüberspannenden Lipiddoppel-schichten zu bilden. Es wird vermutet, dass aus diesem Grund die durch Fusion eingebrachten Lipide sich nicht durch Diffusion über die gesamte Probe verteilen, sondern in der Membran innerhalb einer Pore verbleiben, so dass sich die porenüberspannende Membran tiefer in die Pore zieht. Neben der Calcium-vermittelten Fusion von Vesikeln mit micro-BLMs wurde der Einfluss der molekularen Erkennung auf die Interaktion von großen unilamellaren Vesikeln mit lösungsmittelfreien porenüberspannenden Membranen untersucht. Die Vermittlung des Membrankontakts durch Bindung des Nonapeptid H6WGC an Kopfgruppen-funktionalisierte Lipide führte vorwiegend zu der Anbindung der Vesikel an die porenüberspannenden Membranen. Im Gegensatz dazu wurde durch die Insertion von PNA-Einzelsträngen gekoppelt an den nativen SNARE-Transmembrananker hauptsächlich die Fusion von Vesikeln mit porenüberspannenden Membranen mediiert. Dabei spielt die Sequenz der PNA-Einzelstränge, identisch in beiden Membranen oder komplementär zueinander in Vesikel und porenüberspannender Membran, eine untergeordnete Rolle für die Initiation des Fusionsprozesses. Ein Vergleich mit bereits bekannten Studien zur SNARE-vermittelten Fusion legt den Schluss nahe, dass der Einbau eines Transmembranankers und die damit verbundene Störung der Membranintegrität entscheidend für die Initiation der Fusion sind. Zusätzlich wurde gezeigt, dass eine Destabilisierung des Vesikels entweder durch asymmetrische Bindung von Calcium-Ionen oder durch Einbau der PNA-Peptide ausreichend ist, um Fusionsereignisse einzuleiten. So wird vermutet, dass die Spannung in den porenüberspannenden Membranen ihre Fusogenität so stark erhöht, dass keine zusätzliche Wechselwirkung mit einem Fusogen oder eine Destabilisierung notwendig ist, um die Membranvermischung zu initiieren.