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Wirkung der proinflammatorischen Zytokine TNFα und IL-1β auf die Aktivität und die Proteinmenge der Dual-Leucine-Zipper-Bearing Kinase in einer Betazelllinie

Effect of the proinflammatory cytokines TNFα and IL-1β on the dual-leucine-zipper-bearing kinase in a pancreatic islet beta-cell line

by Catarina Klimpel
Doctoral thesis
Date of Examination:2011-05-30
Date of issue:2011-05-27
Advisor:PD Dr. Elke Oetjen
Referee:PD Dr. Elke Oetjen
Referee:Prof. Dr. Martin Oppermann
Referee:Prof. Dr. Patricia Virsik-Köpp
crossref-logoPersistent Address: http://dx.doi.org/10.53846/goediss-1008

 

 

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Name:klimpel.pdf
Size:1.25Mb
Format:PDF
Description:Dissertation
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Abstract

English

Aims/hypothesis:. In obesity, the production and secretion of the proinflammatory cytokines tumor necrosis factor alpha (TNFα) and Interleukin-1 beta (IL-1β) are enhanced. These two cytokines have been implicated in the molecular pathogenesis of diabetes mellitus. Previous studies showed that both cytokines induce beta-cell apoptosis. Their molecular mechansism is not fully clarified, yet. In the present study the effect of the cytokines on the dual-leucine-zipper-bearing kinase (DLK), known to induce beta-cell apoptosis, was investigated. Material and Methods:. Biochemical assays including immunoblots, transient transfections and immunoprecipitation-kinase assays were employed. Results:. TNFα stimulated the enzymatic activity of cellular, immunoprecipitated DLK 1.5 fold. The reduction of cellular DLK by small interfering RNA attenuated both the TNFα-induced and basal phosphorylation of the pro-apoptotic c-Jun N-te! rminal kinase (JNK). In addition, TNFα-induced decrease of the anti-apoptotic protein BclXL diminished applying DLK-RNAi. In spite of activating the DLK downstream kinase JNK in a time-dependent way, IL-1β did not activate DLK in an in vitro kinase assay. Both cytokines reduced the amount of cellular DLK in a time dependent manner. Additional treatment with the proteasome inhibitors lactacystin and epoxomicin attenuated the cytokine-induced degradation of DLK, suggesting that IL-1β and TNFα might interfere with the proteasomal degradation of the kinase. This effect of the cytokines is abrogated by applying kinase dead mutants indicating that degradation is dependent on the catalytic activity of the DLK. Conclusion/interpretation:. These data suggest that the activation of DLK contributes to TNFα-induced beta-cell apoptosis. In contrast, this MAPKKK does not participate in IL-1β-induced beta-cell apoptosis.
Keywords: beta-cell; DLK; JNK; cytokines; apoptosis; protein degradation

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Beim Diabetes mellitus Typ 2 kommt es durch eine Dysbalance von Replikation und Apoptose der pankreatischen Betazellen sowie durch eine periphere Insulinresistenz zu einer gestörten Glukosehomöostase. Die proinflammatorischen Zytokine TNFα und IL-1β sind dabei wichtige pathogene Effektoren, wobei die Signaltransduktion, über die sie auf die Betazellen wirken, noch nicht vollständig geklärt ist. Die MAP3K DLK ist eine wichtige Komponente in der Regulation des programmierten Zelltodes, da sie neben der Aktivierung der JNK mit ihren proapoptotischen Einflüssen auch den Transkriptionsfaktor CREB inhibiert, wodurch dessen antiapoptotische Funktion reduziert wird. In der vorliegenden Arbeit wird der Einfluss besagter Zytokine auf die katalytische Funktion der DLK und auf die ihr im MAPK-Signalweg untergeordnete JNK in der insulinproduzierenden Betazelllinie HIT-T15 untersucht. In in-vitro-Kinase-Assays mit immunpräzipitierter DLK konnte eine TNFα-induzierte Aktivierung d! er katalytischen Funktion der DLK nachgewiesen werden und durch Reduktion der zellulären DLK in Folge des Einsatzes von DLK-RNAi zeigte sich eine Beteiligung dieser Proteinkinase an dem TNFα-induzierten JNK-Signalweg. Des Weiteren kam es unter der Inhibition der JNK zu einer Reduktion der katalytischen Aktivität der DLK, was die Vorstellung stützt, dass diese Bestandteile des MAPK-Signalweges in einer Signal-amplifizierenden Feedback-Schleife miteinander verbunden sind. Für die Beteiligung der DLK an der IL-1β-induzierten JNK-Aktivierung konnten in den analog zu den Versuchen mit TNFα durchgeführten in-vitro-Kinase-Assays keine Belege gefunden werden, somit sind andere MAP3Ks für die Aktivierung der JNK in den HIT-T15-Zellen zu erwägen. Beide Zytokine führen im Immunoblot-Verfahren zu einer Reduktion der DLK-Proteinmenge, eventuell im Rahmen eines Schutzmechanismus der Betazellen. Diese Reduktion wird eher durch proteasomale Degradation des Proteins als durch ein! e Hemmung der Proteinsynthese verursacht und erfolgt nur in A! bhängig keit der intakten katalytischen Funktion der DLK. In Zusammenschau der vorliegenden Ergebnisse ist davon auszugehen, dass die DLK in Abhängigkeit von ihrer katalytischen Funktion an dem Zytokin-induzierten Untergang der Betazellen beteiligt ist.
Schlagwörter: Betazellen; DLK; JNK; Zytokine; Apoptose; Proteinabbau
 

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