Establishment of a novel technique to study G protein-coupled receptor activation
Entwicklung einer neuen Technik zur Analyse der Aktivierung G-Protein-gekoppelter Rezeptoren
by Minou Susan Djannatian
Date of Examination:2011-08-17
Date of issue:2011-08-17
Advisor:PD Dr. Moritz Rossner
Referee:Prof. Dr. Mikael Simons
Referee:Prof. Dr. Wolfram-Hubertus Zimmermann
Referee:Prof. Dr. Blanche Schwappach
Persistent Address:
http://dx.doi.org/10.53846/goediss-1060
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Format:PDF
Description:Dissertation
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Abstract
English
G protein-coupled receptors (GPCRs) constitute the largest receptor family in mammals and represent important drug targets. Signaling through GPCRs mediates physiological effects that are strongly dependent on the cellular context. Therefore, the availability of assays monitoring GPCR activation applicable in different cell types could help to better understand GPCR functions and to realize the potential of known substances as well as novel ones. Here, we introduce a split-TEV (tobacco etch virus) assay to monitor GPCR activation through the stimulation-dependent recruitment of β-arrestin 2. Inactive N- and C-terminal fragments of the TEV protease are coupled to a GPCR and β-arrestin 2, respectively. Ligand-dependent interaction of the two fusion proteins leads to functional complementation of the TEV protease, followed by the cleavage of an artificial transcription factor and successive reporter gene activation. The presented split-TEV assay system is highly sensitive and was successfully applied in heterologous cell lines as well as in primary cultured neuronal and glial cells. We show that assay performance strongly depends on the endogenous properties of different cell types. The sensitivity and flexibility make split-TEV assays a valuable tool to analyze GPCR activation in different cell types in a rapid and cost-effective way.
Keywords: signal transduction; Split-TEV; Cell-based GPCR assay; β-Arrestin; Luciferase; Primary cells
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G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) erfüllen vielfältige Funktionen in der Zelle und spielen eine große Rolle in der Medikamentenentwicklung. Die durch GPCRs vermittelten Signalprozesse sind wesentlich vom zellulären Kontext abhängig. Aus diesem Grund kann die Anwendung von GPCR-Aktivierungsassays in verschiedenen Zelltypen zum Verständnis von GPCR-Funktionen sowie bisher unbekannter Substanzwirkungen beitragen. Es wurde ein sog. Split-TEV-Assay entwickelt, bei dem die stimulationsabhängige Interaktion von β-arrestin 2 mit GPCRs als Korrelat für die GPCR-Aktivierung verwendet wurde. Dabei wurden inaktive N- und C-terminale Fragmente der TEV-Protease an den GPCR bzw. an β-arrestin 2 gekoppelt. Dabei führt die Interaktion der beiden Fusionsproteine zur Rekomplementierung der TEV-Protease und nachfolgender Abspaltung eines Transkriptionsfaktors sowie Reportergenaktivierung. Split-TEV-Assays für GPCR-Aktivierung sind in transient transfizierten Zellen ein sensitives Messinstrument und können in verschiedenen heterologen Zelllinien, aber auch in primären Zellen angewendet werden. Die Funktion der Assays ist deutlich von den endogenen Eigenschaften der verwendeten Zelltypen abhängig. Durch die hohe Sensitivität und Flexibilität sind Split-TEV-Assays ein wertvolles Werkzeug, um GPCR-Aktivierung in verschiedenen Zelltypen schnell und kosteneffektiv zu analysieren.
Schlagwörter: Signaltransduktion; Split-TEV; zellbasierter GPCR-Assay; β-Arrestin; Luciferase; primäre Zellen