Etablierung einer Methode zur Herstellung von adulten pluripotenten Stammzellen

Abstract

Der irreversible Verlust von Kardiomyozyten nach Myokardinfarkt führt in vielen Fällen zur chronischen Herzinsuffizienz. Ein viel versprechender Ansatz zur Organregeneration stellt die stammzellbasierte Zelltherapie dar. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde die direkte Herstellung von adulten pluripotenten Stammzellen aus adulten Zellen untersucht. Im ersten Teil der Arbeit wurden hierfür mesenchymale Stammzellen (MSCs) der Maus und des Menschen im Vergleich zu pluripotenten embryonalen Stammzellen (ESCs) untersucht. Eine vergleichbare Expression von Marker der Pluripotenz auf mRNA- und Proteinebene bei MSCs gegenüber ESCs konnte nicht gezeigt werden. Jedoch kam es zu einer schwachen und variablen Expression einzelner Pluripotenzmarker wie z.B. Oct4. Ein weiterhin untersuchtes Differenzierungspotential in Kardiomyozyten bestand nicht. Somit konnte keine Pluripotenz für MSCs nachgewiesen werden. Weiterhin wurde die Fähigkeit der Reprogrammierung von MSC mittels ESC-Zytoplasma untersucht. Es wurde einen Methode zur ESC-Zytoplasmafragmentisolation etabliert. Hierbei konnten ESC-Zytoplasmaframente mit einer Reinheit von 95% isoliert werden. Nach Fusion von MSCs mit ESC-Fragmenten wurden die gewonnenen Zellen hinsichtlich ihrer Pluripotenz auf mRNA und Proteinebene untersucht. Dabei zeigte sich, dass eine einmalige Fusion von MSCs mit ESC-Zytoplasma zu keiner Pluripotenz der untersuchten Zellen führt. In einem zweiten Teil der Arbeit wurden unipotente, adulte spermatogoniale Stammzellen (SSCs) in Abhängigkeit von Kulturbedingungen hinsichtlich ihres Pluripotenzpotentials untersucht. Hierbei konnte gezeigt werden, dass adulte SSCs der Maus eine Abhängigkeit gegenüber Kulturbedingungen aufweisen und in Kultur mit Leukemia inhibitory factor (LIF) und Gegenwart von maus embryonalen Fibroblasten (MEFs) in eine pluripotenten Status konvertieren können. Die so gewonnenen Zellen zeigten eine ESC-ähnliche Morphologie und starke alkalische Phosphataseaktivität. Eine kontinuierliche Expression von Oct4, Nanog, Utf1, Esg1 und Rex1 vergleichbar mit ESCs konnte auf mRNA-Level bestätigen werden. Weiterhin konnten wir ein Proteinexpression vergleichbar mit ESCs für Oct4, Nanog, Sox2 und SSEA1 nachweisen. Somit konnten initial unipotente adulte SSCs durch Kulturbedingungen in einen pluripotenten Status reprogrammiert werden. Die unter dieser Kultur gewonnenen Zellen bezeichneten wir als multipotente adulte Keimbahn Stammzellen (maGSCs). Unsere Daten zeigen, dass MSCs keine Pluripotenz aufweisen und nicht durch einmalige Fusion mit ESC-Zytoplasma reprogramiert werden können. Jedoch können initial unipotente adulte SSCs durch Kulturbedingungen in einen pluripotenten Status konvertiert werden. Die erfolgreiche Isolation von pluripotenten Stammzellen aus adulten SSCs im Rahmen dieser Arbeit eröffnet neue Perspektiven in der Stammzell-basierten, regenerativen Medizin.