High-Resolution Fluorescence Microscopy with Photoswitchable Fluorescent Proteins
Hochauflösende Fluoreszenzmikroskopie mit fotoschaltbaren fluoreszenten Proteinen
Hannes Bock
Doctoral thesis
Date of Examination:
2008-12-18
Date of issue:
2009-02-12
Advisor:
Eggeling, Christian Dr.
Referee:
Münzenberg, Markus Prof. Dr.
Referee:
Hell, Stefan Prof. Dr.
Persistent Address: http://hdl.handle.net/11858/00-1735-0000-0006-B47F-C
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Name:
bock.pdf
Size:
12,6 MB
Format:
PDF
Description:
Dissertation
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Abstract
English
The diffraction limit in far-field fluorescence microscopy can be overcome by photoswitching the marker molecules between a fluorescent and a non-fluorescent state. Photoswitching enables the successive generation and readout of nano-sized fluorescent areas in the sample. Subsequently, these areas can be assembled to form a super-resolution image of the specimen. For the first time in this work, one and the same molecular switching mechanism of a reversibly switchable fluorescent protein (RSFP) was used to realize two alternative variations of this general nanoscopy principle: one based on the targeted switching of ensembles of molecules and the other based on the stochastic switching of single emitters. RSFPs are of particular interest for these techniques because they allow the non-invasive study of processes in living cells and can be efficiently switched using low light intensities, thus minimizing photo stress and possible photo-induced damage of the cell. Furthermore, the protein"s photoswitching properties can be improved via targeted mutagenesis. In the case of both nanoscopy techniques presented here, image acquisition could be significantly improved and accelerated as compared to related approaches. For the first time, two-color far-field fluorescence nanoscopy based on the photoswitching of single emitters was successfully realized in biological samples.
Keywords: microscopy; fluorescent proteins; high resolution
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Die Beugungsgrenze in der Fluoreszenzfernfeldmikroskopie kann durch lichtinduziertes Schalten der verwendeten Farbstoffmoleküle zwischen einem fluoreszenten und einem nichtfluoreszenten Zustand überwunden werden. Dazu werden in der Probe durch Fotoschalten nacheinander fluoreszente Bereiche erzeugt und ausgelesen, deren Ausdehnung nicht durch die Wellenlänge des Lichtes begrenzt ist. Durch das nachträgliche Zusammensetzen dieser nanoskopischen Bereiche entsteht ein hochaufgelöstes Bild der Probe. In dieser Arbeit konnten zum ersten Mal mit ein und demselben reversibel schaltbaren Fluoreszentprotein (RSFP) zwei verschiedene Umsetzungen dieses allgemeinen Prinzips realisiert werden, die zum einen auf dem gezielten Schalten von Ensemblen von Molekülen und zum anderen auf dem zufälligen Schalten einzelner Moleküle beruhen. RSFPs sind für diese Verfahren von großer Bedeutung: Sie können Prozesse in lebenden Zellen nichtinvasiv sichtbar machen; sie können bei niedrigen Lichtintensitäten effektiv geschaltet werden, was die Einwirkung auf die Zelle minimiert; und sie können in ihren Eigenschaften als Fotoschalter durch Mutagenese gezielt verbessert werden. Beide der hier vorgestellten Nanoskopieverfahren stellen in ihrer Umsetzung durch eine erhebliche Verminderung der Bildaufnahmezeit eine deutliche Verbesserung im Vergleich zu früheren Ansätzen dar. Zusätzlich wurde zum ersten Mal einzelmolekülbasierte Zwei-Farben-Nanoskopie in biologischen Proben realisiert.
Schlagwörter: Mikroskopie; fluoreszente Proteine; Hochauflösung
