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Untersuchung der Differenzierungskapazität von Osteoblasten und Osteoblastensubpopulationen in vitro und ihre Beeinflussung durch verschiedene Wuchsfaktoren

In vitro differentiation potential of primary human osteoblasts subpopulations. Expression of adipocytic and osteoblastic markers

by María Laura Ponce
Doctoral thesis
Date of Examination:2005-06-28
Date of issue:2005-09-02
Advisor:Prof. Dr. Rüdiger Hardeland
Referee:Prof. Dr. Rüdiger Hardeland
Referee:Prof. Dr. Friedrich-Wilhelm Schürmann
crossref-logoPersistent Address: http://dx.doi.org/10.53846/goediss-1298

 

 

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Name:ponce.pdf
Size:4.00Mb
Format:PDF
Description:Dissertation
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Abstract

English

Knowledge of the basic mechanisms controlling osteogenesis and adipogenesis might provide new insights into the prevention of osteoporosis and age-related osteopenia. In this study, magnetic cell sorting and FACS sorting were employed to obtain primary human osteoblast populations based on alkaline-phosphatase (AP) expression. AP negative human osteoblasts represented an early differentiated population and expressed low levels of adipocytic markers. Under osteogenic conditions these cells expressed the mature osteoblastic phenotype as demonstrated by increased AP-activity and osteocalcin secretion. This was accompanied by increased expression of adipocytic gene markers such as peroxisome proliferator-activated receptor-γ2, lipoprotein lipase and fatty acid binding protein. The induction of adipocytic markers was blocked by transforming growth factor-β1 and promoted by bone morphogenetic protein (BMP-2). Adipocytic markers were more strongly expressed in AP positive than in AP negative cells under standard conditions, confirming that committed osteoblasts exhibit greater adipogenic potential than an early differentiated population. The effects of BMP-2 on the terminal osteoblast and adipocyte differentiation were confirmed by the induction of mineralized nodules and the formation of cytoplasmic lipid vacuoles. We also provide evidence for a concomitant expression of both osteogenic and adipogenic markers proteins in the same cell under osteogenic conditions including BMP-2.
Keywords: BMP; TGF; osteoblasts; adipocytes; transdifferentiation; Plasticity; alkaline phosphatase; osteocalcin; Osteoporosis; osteoblastic markers; primary human osteoblasts; PPAR; LPL

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Mit dem Alter tritt sowohl am langen Knochen als auch an der Wirbelsäule ein Knochenmasseverlust ein. Vom klinischen Standpunkt aus betrachtet, kann dieser Knochenmasseverlust beim Menschen in einem unter dem Namen Altersosteoporose bekannten Krankheitsbild resultieren. Hierbei ist seit Jahren bekannt, daß eine Abnahme des Knochenvolumens im Rahmen der Alterosteoporose mit einer Zunahme des Fettgewebes im Knochenmark einhergeht. Zur Erklärung dieses Phänomens wird die Hypothese aufgestellt, daß die Osteoblasten in Adipozyten transdifferenziert werden. Ziel dieser Arbeit war es, die in vitro Regulation der Plastizität von Osteoblasten und Osteoblastensubpopulationen zu untersuchen. Dafür wurde ein gut charakterisiertes humanes Differenzierungsmodell primärer Osteoblasten (pHOB) verwendet. Die osteoblastäre Differenzierung wurde anhand der Expression von Kollagen-I, AP, OC sowie von Mineralisationskernen nachgewiesen. Die Untersuchung der adipozytären Differenzierungskapazität erfolgte durch den Nachweis der Expression von PPARγ2, LPL sowie von Lipidvakuolen. BMP-2 und TGF-β1 sind Zytokine, denen in einer autokrinen/ parakrinen Form eine essentielle Rolle in der lokalen Knochenhomöostase zugeschrieben wird. Diese sind auch in der Lage in vitro die osteoblastäre Differenzierung mesenchymaler Zellen zu fördern. Hier sollte die modulierende Wirkungen von BMP-2 und TGF- 1 auf die Adipogenese während der Differenzierung von pHOB Zellen untersucht werden. Zunächst wurde ein eventueller Einfluss von verschiedenen BMP-2-Konzentrationen auf die Expression adipozytärer Marker in pHOB Zellen untersucht. Hierbei wurde ein Anstieg der Genexpression des adipozytären Transkriptionsfaktors PPARγ2 unter der geringsten Dosis (50 ng/ ml) von BMP-2 nachgewiesen. Ein weiterer Schwerpunkt dieser Arbeit war die Untersuchung der Plastizität homogener pHOB-Subpopulationen, die mittels MACS gewonnen wurden. Hierbei erfolgten diese Versuche an AP-negativen Zellen, da diese eine frühe Differenzierungsstufe der Osteoblasten (Osteoprogenitoren oder Präosteoblasten) darstellen und somit für die Untersuchung der weiteren Differenzierung geeignet sind. Dabei sollte die adipozytäre Differenzierungskapazität während der osteoblastären Entwicklung AP-negativer Zellen und die modulierende Wirkung von BMP-2 und TGF-β1 näher untersucht werden. Die AP-negativen Zellen waren in der Lage sich im Zeitraum von 7 Tagen sowohl unter Stimulation mit entweder TGF-β1 oder BMP-2 zum reifen Osteoblasten zu entwickeln, gezeigt durch die Induktion der AP-Aktivität sowie eine starke Zunahme der OC-Sekretion. Parallel dazu wurde eine Induktion der Genexpression von PPARγ2 und LPL unter Einfluß von BMP-2 nachgewiesen. Die Induktion des adipozytären Phänotyps in den AP-negativen Zellen konnte hingegen unter Stimulation von TGF-β1 blockiert werden. Die Etablierung der FACS Sorting Methode erlaubte in dieser Arbeit die konstitutive Genexpression von PPARγ2 und LPL zwischen AP-positive und AP-negative Subpopulationen der gleichen Patienten/ Kulturen zu vergleichen. Hierbei wiesen die AP-positiven Zellen verglichen mit der AP-negativen Fraktion eine wesentlich höhere konstitutive LPL Genexpression auf. Bezüglich der PPARγ2-mRNA konnte hier dokumentiert werden, daß PPAR&gamma:2 sowohl von AP-negativen als auch von AP-positiven Zellen ähnlich exprimiert wird. Die in den AP-negativen Zellen nachgewiesenen Effekte von BMP-2 und TGF-β1 wurden in pHOB Zellen durch die Untersuchung der endgültigen Phase der Differenzierung von Osteoblasten und Adipozyten bestätigt. Es wurde nachgewiesen, daß die starke Induktion der OC-Sekretion die sowohl von BMP-2 als auch von TGF-β1 hervorrufen wurde, langfristig einen Mineralisationsprozess auslöste. Auch die stimulatorischen Effekte von BMP-2 auf die Genexpression von PPARγ2 und LPL äußerten sich langfristig in der Förderung der späteren Entwicklungsphase von Adipozyten. Die supprimierende Wirkung von TGF-β1 auf die Genexpression von PPARγ2 und LPL wurde hier auch zu einem späteren Zeitpunkt der Adipozytendifferenzierung bestätigt. Mittels Immunogoldzytochemie wurde die Coexpression adipozytärer und osteoblastärer Markerproteine in pHOB Zellen unter Einfluß von BMP-2 nachgewiesen. Die elektronenmikroskopische Untersuchung bestätigte, daß in sekretorisch aktiven Osteoblasten, die OC und AP exprimieren, gleichzeitig eine Expression von PPARγ2 und LPL, stattfindet. Hierbei wurde erstmals eine parallele Induktion osteoblastärer und adipozytärer Marker unter Einfluß von BMP-2 auf Einzelzellebene in pHOB Zellen beschrieben. In dieser Arbeit ist es gelungen die unterschiedliche Wirkung von BMP-2 und TGF-β1 auf beide Differenzierungsprozesse, Adipogenese und Osteoblastogenese, in pHOB Zellen mit verschiedenen Methoden darzustellen und bis zur Einzelzellebene zu überprüfen.
Schlagwörter: BMP; TGF; Osteoblasten; Adipozyten; Transdifferenzierung; Plastizität; alkalische Phosphatase; Osteokalzin; Osteoporose; Osteoblastendifferenzierung; primäre humane Osteoblasten; Coexpression; PPAR; LPL
 

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