Kristallisation von GGA-Proteinen und röntgenkristallographische Untersuchungen am Cα-Formylglycin Generierenden Enzym

Abstract

GGA-Proteine bilden eine Familie von monomeren Clathrin-Adaptorproteinen, die bei der Sortierung von Mannose-6-Phosphat Rezeptoren vom trans-Golgi-Netzwerk zu den Endosomen eine Rolle spielen. Strukturelle Untersuchungen der GGA-Proteine beschränken sich bisher auf die Beschreibung der isolierten funktionellen VHS-, GAT und GAE-Domäne sowie der Wechselwirkungen, die diese mit ihren jeweiligen Bindungspartnern eingehen. Die Struktur eines intakten GGA-Proteins wurde bisher nicht bestimmt. Es sind auch keine Strukturen verfügbar, die Aussagen über die relative Orientierung der einzelnen Domänen zueinander zulassen. Um neue Strukturen von GGA-Proteinen zu gewinnen, wurden in dieser Arbeit GGA Fragmente, die mehr als eine isolierte Domäne dieser Proteine umfassen, auf ihre Eignung zur Kristallisation und Röntgenstrukturbestimmung geprüft.Sulfatasen nutzen Formylglycin als katalytischen Rest in ihrem aktiven Zentrum zur Hydrolyse von Sulfatestern. Die posttranslationale Modifikation eines Cysteinrestes zu Formylglycin wird in einer sauerstoffabhängigen Reaktion durch das Fomylglycin Generierende Enzym (FGE) katalysiert. Wie die Oxidation eines Cysteinrestes durch FGE vermittelt wird ist bisher nicht im Detail verstanden. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die Strukturen der katalytisch inaktiven Mutante FGE Cys336Ser alleine, sowie im Komplex mit pentameren bzw. heptameren Peptiden, die anhand der Aminosäuresequenz von Arylsulfatase A abgeleitet wurden, durch Röntgenstrukturanalyse bestimmt. Die erhaltenen Strukturen zeigen die molekulare Basis für die spezifische Bindung aller humanen Sulfatasen durch FGE und unterstützen einen vorgeschlagenen Katalysemechanismus der Formylglycin-Bildung durch FGE.