Optical Analysis of [Ca2+]i and Mitochondrial Signaling Pathways: Implications for the Selective Vulnerability of Motoneurons in Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS)
Optische Analysen von [Ca2+]i und mitochondrialen Signalwegen: Untersuchungen zur selektiven Verwundbarkeit von Motoneuronen in der amyotrophen Lateralsklerose (ALS)
by Manoj Kumar Jaiswal
Date of Examination:2008-01-23
Date of issue:2009-01-21
Advisor:Prof. Dr. Reinhold Hustert
Referee:Prof. Dr. Friedrich-Wilhelm Schürmann
Referee:Prof. Dr. Ralf Ficner
Referee:PD Dr. Michael Hoppert
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Description:Dissertation
Abstract
English
Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disorder characterized by selective loss of a defined motoneurons (MNs) population in the brain stem and spinal cord of both human ALS and corresponding mouse models of this neurodegenerative disease. While disruptions of [Ca2+]i and a strong interaction between metabolic mechanisms and mitochondria have been associated with selective MNs degeneration, the underlying mechanisms are only little understood. Although the complex etiologies of ALS are not yet fully understood, a variety of studies indicate that mitochondrial dysfunction and disruption of the Ca2+ homeostasis represent critical neuropathological characteristics during the disease progression. On the basis of the studies done so far, little is known about the involvement of mitochondria in Ca2+ regulation of HMNs in 8-9 and 14-15 weeks adult WT and corresponding SOD1G93A mice. Therefore, the first aim of this dissertation was to define and evaluate the contribution of mitochondria in Ca2+ signaling and clearance of physiological Ca2+ loads in adult brain stem slice preparations from SOD1G93A mice containing selectively vulnerable HMNs and to compare the results to the corresponding wild-type (WT) littermates. Second, the work aimed at characterizing the cellular and morphological consequences of mitochondrial dysfunction in SH-SY5Y cells transfected with WT-SOD1 and SOD1G93A gene, with special attention to alteration in Ca2+ homeostasis. Furthermore, in order to check if calbindin-D28K (CB-D28K) protects cells from dysfunction and degeneration via buffering of [Ca2+]i, Ca2+ involvement as a risk factor was studied in primary cultured neuronal cells at days E18 from cortex of mouse that expresses different levels of (low and high) CB-D28K , as was previously shown that Ca2+-binding proteins such as CB-D28K and PV are absent in MN populations (HMNs/SMNs) lost early in ALS. Finally, we intend to study the mechanisms and possible role of glia in MNs-glia signaling, leading to MNs and glial cell death as a consequence of alterations in glutamate signaling, hypoxia induced cell death, mitochondrial depolarization and their clinical relevance in ALS.To elucidate the underlying factors as well as consequences of mitochondrial dysfunction in ALS on MN membrane properties and intracellular Ca2+ homeostasis, we utilized rapid camera based CCD imaging techniques in 8-9 and 14-15 weeks adult brain stem slice preparations from mouse containing selectively vulnerable HMNs obtained from mSOD1G93A and corresponding healthy MNs in WT littermates. In the case of HMNs, which are vulnerable to cell death in ALS, disruption of the ΔΨm by bath application of the mitochondrial uncoupler FCCP(2µM) provoked a substantial Ca2+ release from mitochondrial stores which was significantly diminished in HMNs of SOD1G93A mice at symptomatic stage (14-15 weeks adult mice) of motor dysfunction. Mitochondrial Ca2+ release responses after FCCP application were almost ~3 fold larger in WT as compared to SOD1G93A animals, supporting the hypothesis that mitochondrial Ca2+ homeostasis is significantly disturbed in the SOD1G93A mice. The application of the SERCA inhibitor CPA to empty the ER Ca2+ store, in the presence of FCCP, resulted in a separate defined Ca2+ release, indicating that ER stores are able to operate independently of mitochondria, but are significantly small and different from FCCP evoked Ca2+ release. Responses of ΔΨm were in agreement with a model, where the presence of the mutated gene leads to a substantial disruption of the ΔΨmm in symptomatic SOD1G93A animals, whereas in corresponding 8-9 weeks WT and pre symptomatic mice ΔΨm remains identical. To evaluate the contribution of mitochondria in buffering Ca2+ loads simultaneously in cytosol and mitochondria, we simultaneously monitor cytosolic ([Ca2+]i) and mitochondrial calcium ([Ca2+]m) concentrations in SH-SY5Y cells transfected with either WT or mSOD1G93A gene. At first, [Ca2+]i was monitored by loading SH-SY5Y cells with the fluorescent dye Fura-2 AM where bath application of 30mM KCl evoked reproducible, voltage dependent Ca2+ elevations, and responses were comparable in wtSOD1 and mSOD1G93A expressing cells. In contrast, bath application of FCCP evoked significantly smaller (~1.86 fold, n = 23 cells) intracellular Ca2+ release responses in mSOD1 expressing cells, suggesting impaired mitochondrial calcium stores. To further test this idea, CCD camera imaging system that allows us to simultaneously monitor [Ca2+]i (Fura-2) and [Ca2+]m concentrations (Rhod-2) with a temporal resolution in millisecond time domain were developed. This permits us to clearly separate dynamic profiles of [Ca2+]i and [Ca2+]m. An experimental observation during different pharmacological conditions (K+, FCCP and Caffeine) supports the concept that the presence of mSOD1 severely disrupts mitochondrial Ca2+ regulation.To explain the consequences of buffering characteristics of MNs (The MNs in ALS showed a low Ca2+ buffering capacity), Ca2+ imaging studies following depolarization induced stimulus (60mM K+) were done in primary neuronal cells expressing CB-D28K. Our data shows that indeed CB-D28K buffers [Ca2+]i where low and high CB-D28K transfected cells display a significant (~2 times) reduction in the peak amplitude of the sustained [Ca2+]i increase. Decay time constant (τ) in CB-D28K transfected cells was also relatively slower (~60s) in contrast to non-transfected cells, where baseline recovery time is ~30-35s while showing little differences in the area under the time - concentration curve (AUC). The observation is in good agreement with the Low buffering hypothesis stating that low buffers provide MNs with rapid Ca2+ dynamics during physiological activity, but represents a significant risk factor during ALS-related MN disease. Further, we made a comparative study of glia, MN s-glia signaling and relationship between [Ca2+]i, ΔΨm and MNs-glia cross-talk. We develop a protocol which allows us a parallel observation of individually identified MNs and glial cells, and thus directly compare the physiological reactions in these two cell types in rat brain stem slice network. This procedure has a main advantage that even subtle differences in reactions can be outlined, because the MNs-glia networks are exposed to identical experimental conditions. We found significant differences between glial cell and MNs Ca2+ signaling. In glutamate treated MNs, the large rise in ROS generation is in parallel with large, sustained, glutamate-mediated Ca2+ influx from the extracellular space, which dominates over the Ca2+ release from the stores. In glial cells, the capacity to down regulate [Ca2+]i clearly provides protection against increased ROS generation. These results indicate that high levels of [Ca2+]i are not necessarily toxic to glia and MNs networks, and potential-driven uptake of Ca2+ into mitochondria is required to trigger NMDA receptor- stimulated neuronal death.Taken together, the results presented here suggest that adult SOD1G93A mouse are characterized by a substantial disruption of the [Ca2+]i / mitochondrial interplay and MN degeneration caused by mSOD1 may be attributed to long term exposures to altered Ca2+ homeostasis and mitochondrial dysfunction. These observations are in good agreement with the models suggesting that an impairment of the Ca2+/ mitochondrial system is a critical element of ALS pathogenesis. A thorough understanding of these events will undoubtedly give clues to a better understanding of the processes involved in MN degeneration and thus help in designing better therapeutic strategies to treat selectively vulnerable MNs in ALS.
Keywords: Amyotrophic lateral sclerosis (ALS); Superoxide dismutase 1 (SOD1); Motoneuron Disease; Calcium buffers; Mitochondria; Brainstem slice; Ca<sup>2+</sup> imaging; Confocal laser scanning microscopy (CLSM); Multiphoton microscopy; Imaging of mitochondria
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Amyotrophe Lateralsklerose (ALS) ist eine fatale
neurodegenerative Erkrankung, die durch den selektiven
Verlust bestimmter Motoneuronen (MNs) im Hirnstamm und
im Rückenmark gekennzeichnet ist. Diese Symptome findet
man sowohl bei humaner ALS als auch bei entsprechenden
Mausmodellen. Obwohl die komplexe Ätiologie von ALS
noch nicht völlig verstanden ist, deuten zahlreiche
Studien darauf hin, dass mitochondriale Fehlfunktionen
und eine Störung der Ca2+-Homöostase
kritische Punkte im Verlauf der Krankheit sind. Aus
bisherigen Studien ist nur sehr wenig über die Rolle
der Mitochondrien in der Ca2+ -Regulation in
8-9 Wochen alten HMNs (Hypoglossale Motoneuronen) und
in 14-15 Wochen alten Wildtyp (WT) -Mäusen bzw. dem
entsprechenden SOD1G93A -Mausmodell bekannt.
Aus diesem Grund war das erste Ziel der vorliegenden
Dissertation, die Rolle der Mitochondrien in der
Ca2+-Singnalgebung zu beschreiben sowie die
Rolle des Abbaus physiologischer Ca2+-Mengen
in Hirnstammschnitten von ausgewachsenen
SOD1G93A-Mäusen, die selektiv betroffene
HMNs besitzen, im Vergleich zu WT-Wurfgeschwistern.
Zweitens beabsichtigte diese Arbeit die zellulären und
morphologischen Konsequenzen einer mitochondrialen
Fehlfunktion in SH-SY5Y-Zellen zu untersuchen, die mit
dem WT-SOD1 und dem SOD1G93A-Gen
transfiziert wurden. Hierbei wurde ein besonderes
Augenmerk auf eine Veränderung der
Ca2+-Homöostase gelegt. Weiterhin wurde
untersucht, ob Calbindin-D28K
(CB-D28K) die Zellen vor Fehlfunktion und
Degeneration schützt, indem es die [Ca2+]i
(cytosolische Ca2+ -Konzentration) puffert.
Die Rolle von Ca2+ als ein Risikofaktor
wurde in Zellkultur primärer Neuronen, vom Tag E18, aus
dem Cortex von Mäusen, die verschiedene Mengen (hohe
und niedrige) an CB-D28K exprimieren
untersucht. Es war bereits früher beschrieben worden,
dass Ca2+-bindende Proteine wie
CB-D28K und PV (Parvalbumin) in den
Motoneuronenpopulationen fehlen, die im frühen Verlauf
von ALS verloren gehen (HMNs/Spinale
Motoneuronen(SMNs)). Schließlich wurde der Mechanismus
und eine mögliche Rolle der Gliazellen im
MN-Glia-Signalwechsel untersucht, der zum Tod von MN
und Gliazellen führt, ausgelöst durch eine Änderung in
der Glutamat-Signalgebung, durch Hopoxie oder
mitochondriale Depolarization und wieweit dies klinisch
bei ALS relevant ist.Um die zu Grunde liegenden Faktoren sowie die
Konsequenzen mitochondrialer Fehlfunktion bei ALS auf
die Membraneigenschaften von MN und die intrazelluläre
Ca2+-Homöostase zu beschreiben, wurde eine
schnelle Kamera basierte CCD-Bildgebungs-Technik
eingesetzt. Mit dieser Technik wurden 8-9 und 14-15
Wochen alte Hirnstammschnitte von Mäusen, die selektiv
verletzbare HMNs haben, die mit mSOD1G93A
erhalten worden waren, und entsprechenende gesunde MN
von WT-Wurfgeschwistern, untersucht. Bei den HMNs, die
anfällig für den Zelltod bei ALS sind, induzierte eine
Unterbrechung des mitochondrialen Membranpotentials
(ΔΨm) durch den mitochondrialen Entkoppler FCCP (2µM)
eine Ca2+ - Freisetzung aus mitochondrialen
Vorräten, die signifikant in den HMNs bei
SOD1G93A-Mäusen im symptomatischen Alter der
Motordysfunktion (14-15 Wochen) verringert war. Die
mitochondriale Ca2+ -Freisetzung nach
FCCP-Applikation war in den WT-Mäusen fast ~3mal größer
als bei den SOD1G93A-Tieren. Dies
unterstützt die Hypothese, dass die Ca2+ -
Homöostase bei SOD1G93A-Mäusen signifikant
gestört ist. Die Anwendung des SERCA-Inhibitors CPA, in
der Gegenwart von FCCP, der ER- (Endoplasmatisches
Retikulums) Ca2+ -Vorräte leert, resultierte
in einer separat definierten Ca2+
-Freisetzung. Dies zeigt, dass die Vorräte im ER
unabhängig von den der Mitochondrien agieren, aber
signifikant kleiner und verschieden von der FCCP
ausgelösten Ca2+ - Freisetzung sind. Der
Effekt des ΔΨm war in Übereinstimmung mit einem Modell,
bei dem das mutierte Gen eine erhebliche Störung von
ΔΨm bei symptomatischen SOD1G93A-Mäusen
auslöste, wogegen ΔΨm bei entsprecheneden WT und
präsymptomatischen SOD1G93A-Tieren nicht
betroffen war. Um die Rolle der Mitochondrien beim
silmutanen Puffern der Ca2+ - Mengen im
Cytosol und den Mitochondrien, zu bestimmen, wurden
gleichzeitig die Ca2+-Mengen im Cytosol
([Ca2+]i) und in den Mitochondrien
([Ca2+]m) in SH-SY5Y Zellen, die mit dem WT
oder dem SOD1G93A-Gen transfiziert worden
waren, gemessen. Zuerst wurde [Ca2+]i
gemessen, indem SH-SY5Y-Zellen mit dem
Fluoreszenzfarbstoff Fura-2 AM markiert wurden. Hierbei
erwiesen sich flüssige Applicationen von 30mM KCl als
reproduzierbar und erzeugten spannungsabhängige
Ca2+ - Anstiege. Diese Reaktionen waren in
wtSOD and mSOD1G93A exprimierenden Zellen
vergleichbar. Im Gegensatz dazu, löste flüssige
Verabreichung von FCCP eine signifikant kleinere
(~1,86fach, n = 23 Zellen) intrazelluläre
Ca2+ - Freisetzung in mSOD1 exprimierenden
Zellen aus. Dies deutet darauf hin, dass die
Calciumspeicherung in den Mitochondrien gestört ist. Um
diese Idee weiter zu verfolgen, wurde ein CCD-Kamera
Bildgebungs-System entwickelt, welches ermöglicht die
[Ca2+]i (Fura-2) und die [Ca2+]m
(Rhod-2) gleichzeitig mit einer zeitlichen Auflösung im
Millisekundenbereich aufzunehmen. Dies erlaubt, die
dynamischen Profile von [Ca2+]i und
[Ca2+]m klar zu unterscheiden.
Experimentelle Beobachtungen unter verschiedenen
pharmakologischen Bedingungen (K+, FCCP und
Koffein) unterstützen das Konzept, dass die
mitochondriale Ca2+ -Regulation in Gegenwart
von mSOD1 stark gestört ist.Um die Folgen der Puffercharakteristika von MN zu
erklären (MN zeigen bei ALS eine niedrige
Ca2+ -Pufferkapazität), wurden
Ca2+ -Bildaufnahmestudien nach einem durch
Depolarization induzieretem Stimulus (60mM
K+) in primären Neuronenzellen, die
CB-D28K exprimieren, durchgeführt. Unsere
Daten weisen in der Tat darauf hin, dass
CB-D28K die [Ca2+]i puffert,
wohingegen hoch und niedrig transfizierte
CB-D28K Zellen eine signifikante Reduktion
(~2mal) der Peakamplitude des anhaltenden
[Ca2+]i-Anstiegs aufweisen. Die Verminderung
der Zeitkonstanste (τ) war in CB-D28K
transfizierten Zellen ebenfalls geringer (~60s), im
Gegensatz zu nicht transfizierten Zellen, wo die
Regenerationszeit von der Nullausgangslinie zwischen
~30-35s beträgt. Dahingegen ist die Differenz in der
Fläche unter der Zeit-Konzentrationskurve (AUC) nur
sehr klein. Diese Differenz ist übereinstimmend mit der
Low buffering Hypothesis , die besagt, dass niedrig
konzentrierte Puffer in MN eine schnelle
Ca2+ -Bewegung (Dynamik) während
physiologischer Aktivität ermöglichen, aber einen
signifikanten Risikofaktor bei ALS-artigen Erkrankungen
darstellen. Weiterhin wurde eine vergleichende
Untersuchung von Gliazellen, der
MN-Glia-Signalinteraktion und dem Zusammenhang zwischen
der [Ca2+]i, des ΔΨm und
MNs-Glia-Wechselwirkungen durchgeführt. Wir
entwickelten ein Protokoll, welches das parallele
Beobachten von individuel ausgewählten MN und
Gliazellen ermöglichte, somit konnte die physiologische
Reaktion der zwei Zellarten im Netzwerk, in Schnitten
aus dem Hirnstamm von Ratten, direkt verglichen werden.
Diese Methode hat den Vorteil, dass auch sehr kleine
Reaktionsunterschiede erkannt werden können, weil das
MN-Glia-Netzwerk denselben experimentellen Bedingungen
ausgesetzt ist. Wir fanden zwischen Gliazellen und MN
signifikante Unterschiede im Ca2+
-Signaling. Bei mit Glutamat behandelten MN ist ein
großer Anstieg der ROS (reaktiven Oxygen Species)
parallel zu einem großen anhaltenden Glutatmat
vermittelten Ca2+-Einstrom aus dem extra
zellulären Raum zu verzeichenen, der gegenüber der
Freisetzung aus Ca2+-Vorräten dominiert. In
Gliazellen ist die Möglichkeit, die [Ca2+]i
herunterzuregulieren, ein Schutz vor der Bildung von
ROS. Dies bedeutet, dass eine hohe [Ca2+]i
nicht notwendiger Weise toxisch für Glia und MN
Netzwerke ist, und dass, die Potential vermittelte
Aufnahme von Ca2+ notwendig ist, um einen
NMDA Receptor vermittelten Zelltod auszulösen.Insgesamt schlagen die hier vorgestellten Resultate
vor, dass ausgewachsene SOD1G93A -Mäuse eine
erhebliche Störung im Wechselspiel der
[Ca2+]i/ und dem Mitochondrium aufweisen und
dass MN- Degeneration, die durch mSOD1 verursacht wird,
ein Kennzeichnen langandauernder Änderung der
Ca2+ -Homöostase und mitochondrialer
Fehlfunktion ist. Diese Ergebnisse stimmen mit Modellen
überein, die vorschlagen, dass eine Störung im
Ca2+ /Mitochondriumsystem ein kritischer
Faktor in der Pathogenese von ALS ist. Wenn diese
Vorgänge komplet verstanden sind, wird dies zweifellos
auch Hinweise zum besseren Verstehen der Prozesse, die
an der MN-Degeneration beteiligt sind, geben. Dies wird
folglich dazu betragen, therapeutische Strategien zu
entwickeln, um selektiv die MN zu behandeln, die bei
ALS betroffen sind.
Schlagwörter: Amyotrophe Lateralsklerose (ALS); Superoxid-Dismutase 1 (SOD1); Motoneuronerkrankungen; Kalzium-Puffer; Mitochondrien; Scheiben des Maushirnstamms; Ca<sup>2+</sup> imaging; Konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie (CLSM); Multiphoton-Lasermikroskopie; Imaging of mitochondrien