Entwicklung von Substraten und Inhibitoren pharmakologisch relevanter Proteintargets
Development of substrates and inhibitors of pharmacologically relevant protein targets
by Daniel Riester
Date of Examination:2005-01-25
Date of issue:2005-11-14
Advisor:PD Dr. Andreas Schwienhorst
Referee:PD Dr. Andreas Schwienhorst
Referee:Prof. Dr. Ralf Ficner
Persistent Address:
http://dx.doi.org/10.53846/goediss-1405
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Description:Dissertation
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Abstract
English
Thrombin: A series of thrombin inhibitors were generated by using powerful computer-assisted multiparameter optimization process. The process was organized in design cycles, starting with a set of randomly chosen molecules. Each cycle combined combinatorial synthesis, multiparameter characterization of compounds in a variety of bioassays, and algorithmic processing of the data to devise a set of compounds to be synthesized in the next cycle. The identified lead compounds exhibited thrombin inhibitory constants in the lower nanomolar range. They are by far the most selective synthetic thrombin inhibitors, with selectivities of >100,000-fold toward other proteases such as Factor Xa, Factor XIIa, urokinase, plasmin, and Plasma kallikrein. Furthermore, these compounds exhibit a favorable profile, comprising nontoxicity, high metabolic stability, low serum protein binding, good solubility, high anticoagulant activity, and a slow and exclusively renal elimination from the circulation in a rat model. Finally, x-ray crystallographic analysis of a thrombin inhibitor complex revealed a binding mode with a neutral moiety in the S1 pocket of thrombin.Histone-Deacetylases HDAC: Human HDAC8 was manufactured as active enzyme with Escherichia coli as effective expression system and purified over an anion exchanger. A fluorogenic HDAC assay with easy to be synthesized substrates was developed. Due to its high sensitivity the assay is feasible for miniaturized assay-formats (microtiterplate MTP). This Assay was optimized by new substrate developments regarding conversion and quantity of necessary substrate, so that a high throughput screening (HTS) suited instrument is available for the search of inhibitors. Different synthetic substrates served to probe the requirements of the proteins regarding structural and stereochemical demands of the substrate and in particular to experience possible structural motives for inhibitors and to find out more over the substrate specificity of the HDAC`s and the processes in their active center. Idications for a two-stage reaction mechanism were found. All preceding tasks can be considered as pre-working for a development of selective, specific inhibitors. This project was begun with few small series of molecules from the class of the peptides, phenylendiamines and pyranone-derivatives, which are to be considered as basis to the further development of non-hydroxamate-inhibitors.
Keywords: thrombin inhibitors; computer-assisted drug discovery; Histone-Deacetylase; HDAC
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Thrombin:
Eine Reihe von direkten Thrombin-Inhibitoren wurden
erzeugt, indem man einen leistungsfähigen
computergestützten Multiparameter-Optimierungsprozeß
verwendete. Der Prozeß wurde in Designzyklen, beginnend
mit einem Satz nach Zufall ausgewählter Moleküle
organisiert. Jeder Zyklus bestand aus kombinatorischer
Synthese, Charakterisierung der Moleküle in einer
Vielzahl von biologischen und physikochemischen Tests
und der algorithmischen Verarbeitung der Daten, um
einen neuen Satz Moleküle im folgenden Zyklus zu
erproben. Die entdeckten Moleküle nach dem achten
Zyklus zeigten Hemm-Konstanten des Thrombins im unteren
nanomolaren Bereich. Sie sind die bei weitem
selektivsten synthetischen Thrombin-Inhibitoren mit
einer Selektivität von 100.000 fach gegenüber anderen
Proteasen wie Faktor XA, Faktor XIIa, Urokinase,
Plasmin und Plasmakallikrein. Ausserdem zeigen diese
Wirkstoffkandidaten ein vorteilhaftes Profil: Sie sind
nicht toxisch, haben eine hohe metabolische Stabilität,
niedrige Serumproteinbindung, gute Löslichkeit, hohe
antikoagulatorische Aktivität und eine langsame renale
Exkretion im Rattemodell. Schließlich zeigt die
röntgenkristallographische Analyse des
Thrombin-Inhibitor- Komplexes einen Bindungsmodus mit
einer neutralen Funktion in der S1-Tasche des
Thrombins.Histondeacetylasen HDAC:
Humane HDAC8 konnte als aktives Enzym mit Escherichia
coli als effektivem Expressions-System hergestellt und
über einen Anionenaustauscher aufgereinigt werden. Ein
fluorogenes HDAC-Assay mit einfach herzustellenden
Substraten wurde entwickelt. Der Assay ist aufgrund
seiner hohen Empfindlichkeit auch in miniaturisierten
Assayformaten (MTP) durchführbar. Dieser Assay konnte
durch neue Substratentwicklungen hinsichtlich Umsatz
und Menge an benötigtem Substrat optimiert werden,
sodaß ein HTS-taugliches Instrument für die Suche nach
Inhibitoren zur Verfügung steht. Bei den Synthesen der
verschiedenen Substrate galt es auch, die Anforderungen
der Proteine in Bezug auf strukturelle und
stereochemische Beschaffenheiten des Substrats
auszuloten, insbesondere hinsichtlich möglicher
struktureller Motive für Inhibitoren und um mehr über
die Substratspezifität der HDAC s und die Vorgänge im
Aktiven Zentrum zu erfahren. Dabei wurden Hinweise auf
einen zweistufigen Reaktionsmechanismus gefunden. Alle
vorangegangenen Aufgaben können als Vorarbeiten einer
Entwicklung selektiver, spezifischer Inhibitoren
gelten. Dieses Vorhaben wurde an wenigen Kleinserien
von Molekülen aus der Stoffklasse der Peptide,
Phenylendiamin- und Pyranonderivaten begonnen, die als
Basis für die weitere Entwicklung von
Nicht-Hydroxamat-Inhibitoren gelten sollen.
Schlagwörter: Thrombin-Inhibitoren; Histondeacetylase
