Generation of Novel Photochromic GFPs: Fluorescent Probes for RESOLFT-type Microscopy at Low Light Intensities

Abstract

Die Auflösung eines konventionellen Lichtmikroskops ist durch die Beugungseigenschaften des Lichts limitiert. Daher können Objekte nicht mehr lichtmikroskopisch unterschieden werden, wenn sie näher aneinander liegen als die Hälfte der Wellenlänge des Lichtes. Diese Beugungsgrenze des Lichts wurde erstmalig durch die STED (STimulated Emission Depletion)-Mikroskopie überwunden, indem die Fluoreszenzfähigkeit von Fluorophoren unter Verwendung intensiver Lichtstrahlung gezielt geschaltet wurde. Diese Arbeit beinhaltet die Entwicklung zweier neuartiger Reversibel Schaltbarer Fluoreszierender Proteine (RSFPs), rsEGFP und rsEGFP2, welche die hochauflösende Mikroskopie von lebenden Zellen unter geringen Lichtintensitäten nach dem RESOLFT (Reversible Saturable OpticaL Fluorescence Transition)-Prinzip ermöglichen. Die einzigartigen Eigenschaften dieser Proteine überwinden die limitierenden Faktoren, welche die Verwendung aller bislang bekannten RSFPs im RESOLFT Ansatz verhinderten. Die rsEGFP-Varianten weisen eine hohe Schaltgeschwindigkeit, eine geringe Restfluoreszenz im Aus-Zustand und ein geringes Schaltbleichen auf, weshalb diese Proteine mehr als 1000 mal geschaltet werden können. Der hier etablierte RSFP-basierte RESOLFT-Mikroskopie-Ansatz ermöglicht das wiederholte Abbilden von Zytoskelettstrukturen lebender Bakterien und Säugerzellen, sowie die Beobachtung von Dendriten innerhalb organotypischer Hypocampusschnitte von Mäusen mit einer Auflösung von <40 nm. Bildwiederholungsraten von bis zu 2 Hz dokumentieren schnelle Bewegungen peroxisomaler Vesikel und des ERs (Endoplasmatisches Reticulum) in PtK2 Zellen unter Verwendung von ~ 1.000.000-fach geringeren Lichtintensitäten im Vergleich zur STED-Mikroskopie. Des Weiteren ermöglichen die verbesserten Schalteigenschaften von rsEGFP dessen Anwendung als Medium für wiederbeschreibbare Datenspeicher. Durch die Adaptierung des Prinzips der hochaufgelösten Mikroskopie an optische Datenspeicheranwendungen kann hier eine Methodik präsentiert werden, die das Schreiben und Lesen von Datenpunkten in geringerer Distanz ermöglicht als es konventionelles Fokussieren erlaubt.