Secondary metabolism and development in the filamentous fungus Aspergillus nidulans - Activation of silent gene clusters and characterization of the SAM synthetase SasA
Sekundärmetabolismus und Entwicklung im filamentösen Pilz Aspergillus nidulans - Aktivierung stiller Gencluster und Charakterisierung der SAM-Synthetase SasA
by Jennifer Gerke
Date of Examination:2012-01-26
Date of issue:2012-12-07
Advisor:Prof. Dr. Gerhard Braus
Referee:Prof. Dr. Gerhard Braus
Referee:Prof. Dr. Axel Zeeck
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Abstract
English
Antimicrobial resistance is spreading whereas the number of newly discovered antibiotics is declining. The genomes of filamentous fungi comprise numerous putative gene clusters coding for biosynthetic enzymes of structurally diverse secondary metabolites, which are rarely expressed under laboratory conditions. Previous approaches to activate these genes were primarily based on artificially targeting the cellular protein synthesis apparatus. In this work, an alternative approach of genetically impairing the protein degradation apparatus of the model fungus Aspergillus nidulans was applied, by utilizing the deletion mutant of the conserved eukaryotic csnE/CSN5 deneddylase subunit of the COP9 signalosome. This defect in protein degradation results in transcriptional activation of a previously silenced biosynthetic gene cluster (dba), comprising an orphaned polyketide synthase (PKS) gene. The direct product of the PKS was isolated and identified as 2,4-dihydroxy-3-methyl-6-(2-oxopropyl)benzaldehyde (DHMBA), which to our knowledge had never been described in an Aspergillus species before and which showed antibiotic activity against Micrococcus luteus. Additionally, a second new A. nidulans compound was identified in wild type as 3,3-(2,3-dihydroxypropyl)diindole (DHPDI), which is lost in a strain overexpressing the specific transcription factor gene dbaA of the PKS gene cluster. This supports the idea of interplay between secondary metabolite pathways, resulting in mutually exclusive metabolite production. Genes for CSN are highly conserved and can easily be identified. Therefore, the construction and analysis of csn mutant strains of other fungi can be a highly promising approach to uncover hidden biosynthetic gene clusters. Expression of biosynthetic gene clusters is regulated by heterochromatin formation, in which S-adenosylmethionine- (SAM-) dependent methylations play a crucial role. The biosynthesis of the ubiquitous methyl group donor SAM from methionine and ATP is catalyzed by the conserved SAM synthetase. The filamentous fungus A. nidulans carries a single gene coding for the SAM synthetase SasA. In this work, the A. nidulans SAM synthetase was comprehensively characterized by genetic, cell biological and biochemical analysis. Deletion of its encoding gene sasA is lethal, and overexpression leads to impaired secondary metabolism and development, including very small sterile fruiting bodies and unusually pigmented auxiliary Hülle cells. This suggests defects in coordination of development and secondary metabolite production, which is emphasized by a putative interaction of the predominantly cytoplasmic SasA with histone-2B, reflecting a putative epigenetic link to gene expression.
Keywords: Aspergillus nidulans; Sekundärmetabolismus; Genregulierung; COP9-Signalosom; Antibiotika; S-adenosylmethionine synthetase; development
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Die Entdeckung neuer Sekundärmetabolite,
welche zur Entwicklung neuer Antibiotika führen, gewinnt zunehmend
an Bedeutung, da im Laufe der letzten Jahrzehnte die Ausbildung von
mikrobiellen Resistenzen gegenüber etablierten Antibiotika stetig
zunahm. Filamentöse Pilze weisen eine Vielzahl von Genclustern auf,
die Enzyme für die Biosynthese von Sekundärmetaboliten kodieren.
Allerdings sind große Teile dieser Gencluster unter
Laborbedingungen reprimiert, was eine erfolgreiche Identifizierung
der Sekundärmetabolite erschwert. Experimentelle Ansätze zur
Aktivierung dieser Cluster basieren unter anderem auf
Modifizierungen des zellulären Proteinsyntheseapparats. Im Rahmen
dieser Arbeit wurde ein alternativer Ansatz angewandt, welcher den
Proteindegradationsweg angreift. Die Deletion des hochkonservierten
csnE/CSN5-Gens, welches eine Deneddylase-Untereinheit
des COP9-Signalosoms kodiert, führt zu einer Fehlregulierung des
Proteinabbaus, wodurch unter anderem Transkriptionsfaktoren für
Gencluster stabilisiert werden, was folglich zu einer Aktivierung
der Genexpression des gesamten Clusters führt. Mithilfe dieser
Methode konnte ein neues Polyketidsynthase-Gencluster und sein
Produkt als 2,4-dihydroxy-3-methyl-6-(2-oxopropyl)benzaldehyde
(DHMBA) identifiziert werden. Unseres Wissens ist dies die erste
Isolierung von DHMBA aus einer Aspergillus-Art und die erste
Dokumentation seiner antibiotischen Aktivität gegen Micrococcus
luteus. Zusätzlich konnte eine zweite neue A.
nidulans-Verbindung, nämlich 3,3-(2,3-dihydroxypropyl)diindole
(DHPDI), aus dem Wildtyp isoliert werden. Interessanterweise wird
dieser Metabolit nicht in einer dbaA-Mutante produziert,
welche den Transkriptionsfaktor des PKS-Clusters vermehrt
produziert. Dies lässt auf ein regulatorisches Zusammenspiel
zwischen dem DHMBA und dem DHPDI produzierenden Gencluster
schließen. Da der CSN-Komplex in Eukaryoten hochkonserviert ist,
stellt die Analyse der CSN-kodierenden Gene einen
vielversprechenden neuen Ansatz zur erfolgreichen Identifizierung
neuer Gencluster und deren Produkte in filamentösen Pilzen dar. Die
Expression von Sekundärmetaboliten-Genclustern wird unter anderem
von der Heterochromatinbildung gesteuert, wobei
S-Adenosylmethionin- (SAM-) abhängige Methylierungen eine
bedeutende Rolle einnehmen. Der ubiquitäre Methylgruppendonor SAM
wird biosynthetisch aus Methionin und ATP gewonnen, einer Reaktion,
die von der SAM-synthetase katalysiert wird. Das Genom des
filamentösen Pilzes A. nidulans kodiert eine SAM-synthetase
SasA, welche im Rahmen dieser Arbeit mit genetischen,
zellbiologischen und biochemischen Methoden charakterisiert wurde.
Es konnte gezeigt werden, dass eine veränderte Expression des
essentiellen sasA-Gens zu Defekten im Sekundärmetabolismus
und der sexuellen Entwicklung führt, welche sich in der Ausbildung
von Mikrocleistothecien und ungewöhnlich pigmentierten Hülle-Zellen
äußert. Dies lässt auf eine defekte Koordination zwischen
Sekundärmetabolismus und Entwicklung schließen, was durch eine
putative Proteininteraktion des hauptsächlich im Cytoplasma
lokalisierten SasA mit Histon-2B gestützt wird. Diese Interaktion
stellt eine mögliche epigenetische Verbindung zur Genexpression
dar.
Schlagwörter: Aspergillus nidulans; secondary metabolism; gene regulation; COP9 signalosome; antibiotics; S-adenosylmethionin-Synthetase; Entwicklung