Über die Tumorigenität und den potenziellen Nutzen ausgewählter Stammzellersatztherapien in dem 6-Hydroxydopamin-Parkinsonmodell der Ratte

Über die Tumorigenität und den potenziellen Nutzen ausgewählter Stammzellersatztherapien in dem 6-Hydroxydopamin-Parkinsonmodell der Ratte

Stem cell therapy in a parkinson animal model: tumorigenicity and functional integration.

Charles-Arnold Timäus

Doctoral thesis

Date of Examination: 2012-06-12

Date of issue: 2012-05-29

Advisor: Paulus, Walter Prof. Dr.

Referee: Paulus, Walter Prof. Dr.

Referee: Dressel, Ralf Prof. Dr.

Referee: Oppermann, Martin Prof. Dr.

Persistent Address: http://hdl.handle.net/11858/00-1735-0000-000D-EFBB-C

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Abstract

English

Parkinson's disease is the second most neurodegenerative disorder behind Alzheimer's disease. To date, treatments consist of symptomatic therapies, e.g. L-Dopa substitution, direct dopaminergic stimulation or deep brain stimulation in later stages. Therefore it is crucial to develop strategies aiming at the causative factor of the progressive cell death of the substantia nigra pars compacta being considered as the hallmark of this movement disorder. Cell replacement seems to be a promising treatment for patients suffering from Parkinson disease. But ethical conflicts due to using stem cells and incidence of tumor formations seen after transplantation are obstacles that have to be overcome. The present work investigated the tumor rates after transplantation of dopaminergic neurons generated from differentiated stem cell lines (Eras, OS25, HT2) compared to murine embryonic stem cells (MPI1). Furthermore, behavioral tests were done in order to find evidence for functional integration of the grafted cells. Differentiated and undifferentiated stem cells were grafted into the 6-Hydroxdopamine parkinson rat model. Cyclosporin A was injected for 5 weeks in order to prevent immune rejection. Behavioral investigations were performed by using a drug induced rotameter test, rotarod test and the cylinder test. Histochemical and antibody staining were done in order to identify tumor formation and dopaminergic neurons. 52% of the 91 grafted animals (18 Eras; 18 MPI1; 20 OS25; 35 HT2) show tumor formations. Highest tumor rate was found after transplantation of OS25-cells (70%) followed by HT2-cells (66%) and MPI1/Eras-cells (both 28%). A significant improvement in rotarod test was seen when grafts were positive for TH (Tyrosinhydroxylase) but no tumor formation was described (p=0,009). Furthermore, apomorphine induced rotations were significantly reduced in tumor free animals with TH-positive staining compared to animals without TH-staining (p=0,02). Grafts with differentiated stem cells lead to higher tumor rates than graf ts with undifferentiated stem cells. If tumor formation was absent a functional integration could be found. Thus, not only undifferentiated stem cells in grafts but also a minor cell group consisting of pre-differentiated, still pluripotent stem cells may be responsible for generating tumor formation after transplantation. In future, these putative tumorigenic cells must be characterized and eliminated before stem cell therapy could be translated from animal models to clinical trials.

Keywords: stem cell; dopaminergic neurons; parkinson

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Der Morbus Parkinson ist die zweithäufigste neurodegenerative Erkrankung nach der Alzheimer-Demenz. Breites wissenschaftliches Interesse gilt dem gezielten Ersatz der von dem neurodegenerativem Prozess erfassten Zellen. Zielstrukturen bei der Parkinsonschen Erkrankung sind dopaminerge Neurone der Substantia nigra, deren Untergang das entscheidende Merkmal dieser fortschreitenden Bewegungsstörung ist. Experimentelle Zellersatzstrategien mit murinen und humanen Stammzelllinien in Tiermodellen weisen bis dato auf eine mögliche funktionelle Integration und eine gewisse Tumorigenität der transplantierten Gewebe hin. Gegenstand der vorliegenden Arbeit war es, verschiedene Stammzelllinien auf die Fähigkeit zur funktionellen Integration und auf die Bildung von Tumoren zu untersuchen. Undifferenzierte Stammzellen bzw. zu dopaminergen Neurone differenzierte Stammzellen wurden in ein unilaterales 6- Hydroxydopamin- Parkinsonmodell der Ratte transplantiert. Immunsuppression erfolgte mit täglichen Cyclosporin A- Injektion für 5 Wochen nach Transplantation. Verhaltensversuche umfassten einen Medikamenten- induzierten Rotationstest, Rotarodtest und Zylindertest. Histochemische und immunhistologische Untersuchungen dienten zum Nachweis von Dopamin produzierenden Neuronen und von Tumorgewebe. Von 91 transplantierten Tieren (18 Eras; 18 MPI1; 20 OS25; 35 HT2) wiesen 52 % eine Tumorbildung auf. Mit 70% zeigte die OS25-Zellinie die höchste Tumorigenität, gefolgt von der HT2-Zellinie (66%) sowie der Eras- und MPI1- Zelllinie (jeweils 28%). Tiere mit TH (Tyrosinhydroxylase)-positiven aber tumorfreien Transplantaten wiesen eine signifikante Verbesserung im Rotarodtest auf (p=0,009). Ebenso zeigten Tiere mit TH-positiven aber tumorfreien Transplantaten eine signifikante Reduktion der Rotationen nach Apomorphingabe im Vergleich zu den Tieren ohne Nachweis von TH (p=0,02). Die gefundene Tumorrate variierte von 28-70%, wobei differenzierte Stammzelllinien höhere Tumorraten aufwiesen als undifferenzierte murine Stammzellen. Eine funktionelle Integration der dopaminergen Neurone war nachweisbar, sofern eine Tumorbildung in den Transplantaten ausblieb. Neben undifferenzierte Stammzellen sind nicht endgültig differenzierte, noch pluripotente Zellen als möglicher Ursprung von Tumorgewebe anzunehmen. Die Identifikation, Charakterisierung und Eliminierung dieser Zellen scheinen für eine ausreichende Tumorreduktion und die klinische Anwendung der Stammzell- basierenden Zellersatztherapie unabdingbar.

Schlagwörter: stammzellen; dopaminerge Neurone; Parkinson