NMR Spectroscopic studies of calmodulin plasticity in calcium signalling

Abstract

Dieser Arbeit befasst sich mit den strukturellen und dynamischen Aspekten der Kalzium Signal Transduktion von Calmodulin (CaM). Dieses Protein ist intensiv erforscht worden, da es eine Vielzahl von Interaktionspartnern reguliert und in Schlüsselprozessen, wie Proteinphosphorylierung, -dephosphorylierung und Transkription involviert ist. Darüber hinaus ist ein Model eines Zwei-Domänen-Proteins, welches Kalzium kooperativ bindet. Die strukturelle Pionierarbeit, sowohl kristallographisch (Babu et al., 1988), als auch NMR-spektroskopisch (Ikura et al., 1992; Barbato et al., 1992) hat gezeigt, dass beide Calmodulindomänen durch einen flexibler Linker verbunden sind, was ein hohes Maß an konformativer Freiheit zulässt. Bedingt dadurch können beide Domänen unterschiedliche Orientierungen einnehmen, um ihre Interaktionspartner zu erkennen und zu aktivieren. Nach der Kalziumbindung erfahren die EF-Hand-Motive eine umfangreiche Konformationsänderung, wodurch hydrophobe Seitenketten auf der Oberfläche präsentiert werden und eine hydrophobe Wechselwirkung mit ihren Partnern eingehen. Hierbei spielen besonders Methioninseitenketten eine wichtige Rolle (Siivari et al., 1995). Der Teil, der sich mit der Dynamik von CaM befasst, nutzt anisotrope NMR Bedingungen, um Bewegungsvorgänge im bis zum Millisekundenbereich „abzutasten“. In Lösung belaufen sich solche anisotropen Interaktionen, bedingt durch die Molekularbewegung, im Durchschnitt auf Null. Daher lassen sie sich nur unter speziellen Probenbedingungen beobachten (und messen). Im Rahmen dieser Arbeit wurden Lanthanoid-komplexierte, auf EDTA-basierende, paramagnetische Tags verwendet, die über Cysteinseitenketten an CaM gebunden sind. Das allein stehende ungepaarte Elektron des paramagnetischen Lanthanoid-Ions bewirkt eine starke anisotropische magnetische Suszeptibilität, die das Makromolekül im Magnetfeld ausrichtet. Mit dieser Methode war es möglich, Unterschiede zwischen drei aktivierten Zuständen von CaM zu untersuchen (apoCaM, holoCaM und CaM-C20W-Peptid-Komplex). Dabei zeigte die paramagnetische Anordnung der CaM-S17C Mutante einen Unterschied im dynamischen Verhalten zwischen apoCaM und holoCaM anhand von, in der Linker-Region gemessener, Pseudokontaktverschiebungen. Durch die Messung dipolarer Kopplungen der CaM-T146C Mutante im freien und komplexierten Zustand mit dem Peptid (C20W) der membrangebundenen Ca2+-ATPase-Pumpe, konnten ebenfalls Unterschiede im dynamischen Verhalten beobachtet werden. Bertini et al. (2004) beschrieb eine verbliebene Ausrichtung der C-terminalen Domäne von rund 10%, wenn ein Lanthanoid-Ion direkt N-terminal von holoCaM gebunden wird. In dieser Arbeit konnte, übereinstimmend in drei unabhängigen Messungen, eine verbliebene N-terminale Ausrichtung von 25% im Komplex mit C20W beobachtet werden. Im Gegensatz dazu wurde für den N-Terminus von holoCaM keine verbliebene Orientierung gemessen, da das Alignment des paramagnetischen tags (bis zu 8 Hz dipolare Kopplungen am 900 MHz Spektrometer) zu schwach ist und die Ergebnisse in der Grössenordnung des Fehlerbereiches liegen. Der strukturelle Teil der Arbeit befasst sich mit der Interaktion von CaM mit dem Diacylglycerol-bindinden Protein Munc13-1, welches eine wichtige Rolle hinsichtlich Neurotransmitterfreisetzung spielt. Junge et al., (2004) fand heraus, dass CaM an eine konservierte Region von Munc13-1 bindet und als Antwort auf Kalziumsignale die Freisetzung solcher Neurotransmitter reguliert. Die vollständige sequenzielle Zuordnung der chemischen Verschiebungen und die gelöste NMR-Struktur des CaM/Munc13-1 (458-492) Peptid Komplexes wird in dieser Arbeit beschrieben. Die 1H, 15N, und 13C chemischen Verschiebungen wurden auf der Biological Magnetic Resonance Data Bank (BMRB) unter der Nummer 15470 abgelegt. Die Struktur beschreibt ein neues bindendes Motiv für CaM, in dem es mit Munc13-1 in zweiteiliger Weise interagiert. Die C-terminale Domäne vom CaM wechselwirkt hierbei mit dem N-terminalen, amphiphilen und -helikalen (1-5-8) Motiv des Munc13-1 Peptids und der CaM-N-terminalen Domäne, so dass eine hydrophobe Interaktion durch eine LW Motiv am C-terminus des Peptids aufgebaut wird. Zu den weiteren Eigenschaften dieses Protein-Peptid Komplexes zählt eine verbliebene Inter-Domänen- Dynamik im sub-Millisekundenbereich, die mittels paramagnetischer dipolarer Kopplungen untersucht wurde, sowie die Verschiebung eines Monomer-Dimer Gleichgewichtes in Richtung eines 2:2 Komplexes, unter Verwendung höherer Salzkonzentrationen. Electrophysiologische Studien an primären Neuronalkulturen von Munc13-1 Mutanten, die eine Unempfindlichkeit gegenüber CaM (W464R) und Phorbolester (H567K) aufweisen, zeigten eine vergleichbare Eigenschaft hinsichtlich der Auflösung von Neurotransmittervesikeln (Junge et al., 2004; Rhee et al., 2002). Dies wiederum regte die Studie der Interaktion zwischen CaM und einem Fragment von Munc13-1 an, welches beide, die CaM- und Diacylglycerol/Phorbolester-C1 bindende Domäne enthält. Die 15N markierte NMR Probe zur Untersuchung dieses Protein-Protein Komplexes, konnte mittels einer Co-Expression hergestellt und anschließend untersucht werden. Die Ähnlichkeiten zwischen den HSQC-Spektren des CaM/Munc13-1(458-492) Komplexes und des CaM/Munc13-1(447-631) Proteinkomplexes ermöglichten die Beschreibung einiger neuer Eigenschaften dieses Protein-Protein Komplexes, obwohl keine sequentielle Zuordnung des CaM/Munc13-1(447-631) Komplexes vorgenommen wurde. Erstens, das für den CaM/Munc13-1(458-492) Komplex bereits beschriebene Monomer (1:1)- Dimer (2:2)-Gleichgewicht, ist für den größeren Komplex ebenfalls zu beobachten, jedoch mit einer erhöhten Bindungs-Affinität. Daher war es möglich, das Monomer vom Dimer mittels Größenausschlusschromatographie zu trennen, um jede Spezies unabhängig voneinander untersuchen zu können. Die HSQC-Analyse des monomeren Komplexes des Wildtyps, sowie der W489A- und W588A-Mutanten weist darauf hin, dass die N-terminale Domäne von CaM zwischen zwei hydrophoben Motiven in Munc13-1 wechselt: das LW Motiv, gezeigt in der NMR Struktur, und ein zweites Motiv, innerhalb der C1-Domäne von Munc13-1. Der entscheidende Beweis für die Interaktion zwischen der N-terminalen Domäne vom CaM und der C1-Domäne vom Munc13-1 konnte nicht erbracht werden, aber laufende Studien untersuchen diese Möglichkeit, die eine Brücke zwischen die strukturellen und den genannten physiologischen Studien schlagen würde. Die Untersuchungen des CaM/Munc13-1(447-631)-Dimer-(2:2) Komplexes legen einen konformativen Gleichgewichtsaustausch zwischen der N-terminalen Domäne vom CaM und der C1-Domäne von Munc13-1 nahe. Außerdem gibt es Hinweise darauf, dass der C1-Domänen-Agonist PDBu von Munc13-1 eine Verschiebung des Gleichgewichts in Richtung des Monomers bewirkt, möglicherweise bedingt durch eine reduzierte Autoinhibition. Die Homodimerisierung der C2A Domäne von Munc13-1 wurde in den Studien von Lu et al. (2006) bereits beschrieben. Daher sind weitere Studien, die das Verhältnis zwischen dem Oligomerisierungszustand von Munc13-1 und der Regulation der Neurotransmitterfreisetzung untersuchen, wichtig, um besser verstehen zu können, wie die hoch konservierte C-terminale MUN-Domäne von Interaktionspartnern, wie RIM1 und Rab3A, von der variablen N-terminalen Region der Munc13-Proteine verändern wird. Dies führt zu einer Feinabstimmung der Neurotransmitterfreisetzung im aktiven Bereich der Neuronen. Darüber hinaus gilt es zu klären, wie diese verschiedenen Protein-Protein-Interaktionen die kurzzeitig plastischen Prozesse im Gehirn bewirken könnten.