Expression and functional analysis of the germ cell specific genes ADAM 27 and Testase 2

Abstract

In den vorgelegten Arbeit wurden zwei Mitglieder der ADAM-Familie, ADAM27 und Testase 2 der Maus, untersucht. Beide Gene werden spezifisch in den testikulären Keimzellen exprimiert und deswegen können diesen Gene eine Rolle in der Spermatogenese und/oder beim Fertilisierungsprozess spielen. ADAM 27 ist ein putatives Adhäsionsprotein, und es wird vermutet, dass es an Integrine bindet, die Moleküle auf der Ooocytenoberfläche sind. Die Expression von ADAM27 wurde erstmals in den Spermatocyten detektiert. ADAM 27 findet sich zunächst im Golgi-Apparat und später hauptsächlich im Cytoplasma. Es ist nicht klar, ob das reife Protein während der Reifung der Spermien entfernt wird oder im Akrosom gespeichert wird. Die ersten Ergebnisse deuten jedoch darauf hin, dass ADAM 27 im epididymalen Spermienextrakt zu detektieren ist. Um die Funktion von ADAM 27 in der Spermatogenese und beim Fertilisationsprozess aufzuklären, wurden in vitro und in vivo Ansätze gewählt. Im in vitro Ansatz wurde mithilfe von in vitro sythetisierten rekombinanten ADAM 27-Polypeptiden mit verschiedenen funktionellen Regionen (Disintegrin, Cys-reich, EGF-like) die Rolle des Proteins bei der Spermien-Oocyten Bindung untersucht. Die Ergebnisse aus diesen Experimenten weisen darauf hin, dass ADAM 27 durch die Cys-reiche Domäne an die Zona pellucida von Oocyten bindet. Für die funktionellen Untersuchung von ADAM 27 in vivo, wurde zwei Knockout Konstrukte hergestellt. Bei dem ersten Konstrukt wurde die Transmembrandomäne deletiert. Die homozygoten mänlichen und weiblichen Tiere sind fertil und zeigen keine Abnormalitäten ausser einer reduzierten Spermienmotilität. Bei dem zweiten Konstrukt wurden die ersten drei Exons (mit ATG) deletiert, um die Synthese des gesamten Proteins zu verhindern. Keine der vier produzierten Chimären zeigten Keimbahntransmission, was auf eine Haploinsuffizienz hinweist. Drei von vier Chimären mit über 70% Chimärismus waren infertil. Dies deutet darauf hin, dass ADAM 27 für eine normale Keimzellentwicklung von Bedeutung ist. Das zweite untersuchte Gen war Testase 2, das auch als ADAM 25 bekannt ist. In der Literatur wurde Testase 2 als single copy Gen identifiziert. Unsere Untersuchungen haben aber gezeigt, dass es zwei Kopien des Gens auf Chromosom 8 gibt. Es wurde festgestellt, dass die beiden Gene im selben Spermatogenese-Stadium exprimiert werden. Aus diesem Grund wurden die Experimente für die funktionelle Analyse von Testase 2 in Knockout Mäusen eingestellt. Um die Funktion des Testase 2 Gens aufzuklären, müssen andere Strategien entwickelt werden, in denen die beiden Kopien dieses Gens ausgeschaltet werden.