Governing fungal polar cell extension: Analysis of Rho GTPase and NDR kinase signalling in Neurospora crassa

Abstract

Die Entwicklung gestreckter Zelltypen wie Nervenzellen, Pollenschläuche und Zellen filamentöser Pilze erfordert polare Gestaltbildung. Die grundlegenden Signalwege dafür sind hochkonserviert. Missbildungen der Zellform können zu Entwicklungsstörungen oder dem Tod der betroffenen Zelle führen. In dieser Arbeit werden Komponenten, die für polares Wachstum von Neurospora crassa benötigt werden, auf molekularer Ebene charakterisiert. Dabei handelt es sich zum einen um ein Mitglied der GTPase aktivierenden Proteine, LRG1 und zum anderen um die "germinal center" Kinase POD6.POD6 und LRG1 sind für das gerichtete Hyphenwachstum unabdingbar. Deletionsund temperatur-sensitive Allele der Gene cot-1, pod-6 und lrg-1 zeigen phänotypisch Ähnlichkeiten bezüglich des Abbruchs polaren Wachstums, übermäßiger Verzweigungsbildung und der veränderten Größe der Hyphenkompartemente. Komplementationsexperimente belegen, das sowohl der die drei LIM Domänen enthaltende N-Terminus als auch der die Rho-GAP Domäne enthaltende C-Terminus von LRG1 für dessen Funktion benötigt werden. Neben genetischen Hinweisen identifizieren in-vitro Untersuchungen LRG1 als Rho1 spezifisches GAP.COT1, POD6 und LRG1 befinden sich in der Zelle an Stellen aktiven Wachstums. In Immun-Fluoreszenz Untersuchungen wurde eine partielle Ko-Lokalisation von POD6 und COT1 festgestellt. Diese Lokalisierung ist von Mikrotubuli Motorproteinen abhängig. LRG1 zeigt eine ähnliche, an Septen und der Hyphenspitze angereicherte, zelluläre Verteilung. Diese Lokalisation wurde sowohl mit gegen LRG1 gerichteten Antikörpern in Wildtyp-Zellen als auch für MYC9::LRG1 mit Antikörpern gegen das Myc-Epitop gefunden. Ein mit GFP fusioniertes LRG1-Protein findet sich in Abhängigkeit von intakten LIM Domänen und Aktin-Zytoskelett wachstumsabhängig als apikale Kappe, deren Größe mit der Wachstumsgeschwindigkeit korreliert. Ähnlich wie bei POD6 und COT1, wird auch diese Lokalisation wird von den Mikrotubuli Motoren Kinesin und Dynein beeinflusst. LRG1 beeinflusst die Aktivität verschiedener Effektorproteine von Rho1. Mutanten in lrg-1 sind unempfindlicher gegenüber dem Glucansynthase-Inhibitor Caspofungin und Doppelmutanten von lrg-1 mit einer hyperaktiven ß-1,3-Glucansynthase Mutante sind nicht lebensfähig. Die PKC-Inhibitoren Staurosporin und Cercosporamid unterdrücken die Wachstumssörungen von lrg-1 Mutanten, welche zudem empfindlicher gegenüber der Aktin depolymerisierenden Droge Latrunkulin A sind. Zudem wurde eine Unterdrückung der Wachstumsdefekte durch Expression des dominant negativ agierenden N-Terminus des Formins Bni gefunden. Die Untersuchung der Rho1 Wege in einer Mutante der NDR kinase cot-1 zeigte, dass diese Mutation keinen Einfluss auf die getesteten RHO1 Effektoren hat. Diese Experimente legen nahe, das LRG1 als spezifisches GAP für Rho1 verschiedene Effektorwege reguliert und das ein paralleler, von Rho1 unabhängiger, Signalweg zum polaren Wachstum erforderlich ist, in welchem COT1 und POD6 agieren.