Membrane mechanics governs cell mechanics in epithelial cell: how surface area regulation ensures tension homeostasis

Abstract

Die Plasmamembranspannung von eukaryotischen Zellen soll maßgeblich zur Regulation von zellulären Prozessen wie der Zellmigration, Mitose, Endo- und Exozytose, Membranreparatur, Osmoregulierung und Zellspreiten beitragen, welche zu einer Veränderung der Membranfläche und ihrer Deformation führt. In dieser Arbeit wurde die epitheliale Zelllinie MDCK II (Madin-Darby Canine Kidney) benutzt, um spannungsgesteuerte Oberflächenregulierung zu untersuchen. Indentationsexperimente kombiniert mit dem Herausziehen von Membrannanoröhren wurden mit Hilfe des Rasterkraftmikroskops (Atomic Force Microskope, AFM) durchgeführt, um lokale Variationen in der Membranspannung und überschüssiger Membranfläche als Funktion von äußeren Reizen abzuschätzen. Die verwendeten externen Stimuli beinhalten eine Veränderung der Funktionalität des Actomyosin-Cortexes durch die Wirkung von Blebbistatin und Cytochalasin D, sowie die Manipulation der Zytoskelett-Membran Adhäsionspunkte durch Einzel-Mikroinjektion. Die Injektion von Neomycin verhindert die Anbindung von ERM-Proteinen an das Lipid Phosphatidylinositol-(4,5)-bisphosphat (PIP2) und bewirkt somit die Abkopplung des Zytoskeletts von der Plasmamembran. Als Gegenexperiment diente die Injektion des Lipids PIP2 selbst, welches zur Erhöhung der Anzahl der Zytoskelett-Membran Adhäsionspunkte führte. Weiterhin wurden die als Membranreservoire dienenden Mikrovilli durch den Entzug von Cholesterol entfernt. Auswirkung auf das Vorhandensein von Membranreservoiren hat ebenfalls die Veränderung des osmotischen Drucks innerhalb der Zellen. Zusätzlich wurden die elastischen Eigenschaften von apikalen Zellmembran-Fragmenten von konfluenten MDCK II Zellen untersucht, welche Aufschluss über die intrinsischen Membraneigenschaften ohne den Einfluss des Zytosols und Zytoskeletts geben konnten. Abschließend wurde die Mechanik von adhärierenden und spreitenden Zellen untersucht. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass die Plasmamembran, bestehend aus einer Phospholipiddoppelschicht, lateral schwer ausdehnbar ist aufgrund ihrer flüssig-kristallinen Natur. Durch das Vorhandensein von dynamischen Membranreservoiren wie Mikrovilli, die schnell auf Veränderungen der Membranspannung durch Membranhomöostase reagieren, werden zellulare Prozesse wie die Zellmotilität oder die Anpassung an osmotischen Stress ermöglicht. In der vorliegenden Arbeit gelang es gleichzeitig, die Membranspannung und die Verfügbarkeit von Membranfläche von adhärenten konfluenten als auch von adhärierenden und spreiten Zellen zu messen. Die durchgeführten Experimente ergaben ein detailliertes Bild wie sich die zelluläre Oberflächenregulierung in der Membranmechanik widerspiegelt.