Dynamische Interaktion zwischen Leukozyten und Endothelzellen unter dem Einfluss von TNFα und Adalimumab
Dynamic interactions between leukocytes and endothelial cells under the influence of TNFα and adalimumab
by Anike L. E. Lockmann
Date of Examination:2015-03-31
Date of issue:2015-03-03
Advisor:Prof. Dr. Michael P. Schön
Referee:Prof. Dr. Michael P. Schön
Referee:Prof. Dr. Jürgen Wienands
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Format:PDF
Abstract
English
Several biologics were approved during the past decades for the therapy of psoriasis. One of these compounds is adalimumab, a fully human antibody directed against TNFα, a central cytokine that plays a pivotal role in the pathogenesis of psoriasis. However, a minority of psoriasis patients does not respond sufficiently to adalimumab. To date, it is impossible to predictively distinguish patients who benefit from this therapy from those who do not. Therefore, the latter group of patients are exposed to unnecessary risks and side effects. In this work, interactions between cultured human endothelial cells and lymphocytes were examined ex vivo under the influence of adalimumab. With regard to the development of a potential predictive test, endothelial cell-lymphocyte interactions were compared between responders and non-responders. Lymphocytes from healthy donors as well as from psoriasis patients were examined ex vivo regarding interactions with TNFα-treated and untreated cultured endothelial cells (HUVEC). Towards this end, freshly isolated or cryopreserved leukocytes were used, since it has been established in functional flow chamber analyses in the first part of this thesis that controlled freezing did not cause functional alterations in this system. TNFα-treatment of endothelial cells led to increased rolling and firm adhesion of all leukocytes on these endothelial cells, but with considerable inter-individual differences. While these inter-individual differences were observed likewise in leukocytes from psoriasis patients, no significant differences between responders and non-reponders were seen. When the influence of adalimumab-treatment on TNFα-stimulated endothelial cells as well as their interactions with lymphocytes were examined ex vivo, a marked dependency on the time point of TNF-exposure became apparent. Adalimumab-treatment prior to or simultaneous with TNFα-activation of endothelial cells abrogated the effects of TNFα on transcription (PCR) and expression (immunofluorescence) of adhesion molecules as well as on interactions with lymphocytes (flow chamber). Adalimumab-treatment of endothelial cells after exposure to TNFα had no influence, indicating that already initiated processes could not be reversed. This might be an explanation for the delayed effect of adalimumab-treatment in vivo. Overall, the major achievements of this work are as follows: First, it has been shown that important functional properties of human lymphocytes remain intact during controlled cryopreservation. Second, inter-individual differences regarding the interaction between lymphocytes and TNFα-activated endothelial cells were detected. Adalimumab-treatment prior to or simultaneous with TNFα-treatment strongly suppressed these interactions. Third, these inter-individual differences were noticed similarly with lymphocytes from healthy donors and from psoriasis patients. Fourth, these functional differences do not permit a predictive distinction of responders from non-responders to adalimumab-treatment.
Keywords: psoriasis; TNF antagonists; endothelial cells; leukocytes
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In den letzten Jahrzehnten haben sich die so genannten Biologika auch zur Therapie der Psoriasis etabliert. Zu diesen Medikamenten gehört auch Adalimumab, welches als vollständig humaner Antikörper eines der Schlüsselzytokine in der Pathogenese der Psoriasis, TNFα, neutralisiert. Allerdings führt die Therapie nicht bei allen Patienten zu ausreichendem Wirkerfolg. Da bisher vor Beginn der Therapie nicht zwischen den Patienten, die von der Therapie profitieren, und denen, die keine ausreichende Wirkung erfahren, unterschieden werden kann, werden die letzteren unnötigerweise den Risiken und Nebenwirkungen dieser Therapie ausgesetzt. In dieser Arbeit wurden die Interaktionen kultivierter Endothelzellen und Lymphozyten ex vivo unter dem Einfluss von Adalimumab untersucht. Insbesondere auf mögliche Unterschiede zwischen „Respondern“ und „Non-Respondern“ wurde im Hinblick auf die mögliche Entwicklung eines prädiktiven Tests für das Ansprechen auf Adalimumab ein Schwerpunkt gelegt.
Lymphozyten gesunder Probanden und von Psoriasis-Patienten wurden ex vivo hinsichtlich ihrer Interaktion mit kultivierten Endothelzellen (HUVEC), mit und ohne TNFα-Stimulation, untersucht. Hierbei wurden sowohl frisch isolierte als auch kryokonservierte Lymphozyten verwendet, da sich zwischen diesen keine Unterschiede in den funktionellen Flusskammer-Versuchen zeigten. Nach Stimulation der Endothelzellen mit TNFα kam es zu einem deutlichen Anstieg des Rollens und der festen Adhäsion aller Lymphozyten an den Endothelzellen. Allerdings zeigten sich im Ausmaß dieser Interaktion deutliche inter-individuelle Unterschiede. Obwohl diese auch bei Psoriasis-Patienten auftraten, konnten keine signifikanten Unterschiede zwischen „Respondern“ und „Non-Respondern“ beobachtet werden.
In den Untersuchungen zum Einfluss von Adalimumab auf TNFα-stimulierte Endothelzellen sowie die Interaktion dieser mit Lymphozyten ex vivo zeigte sich eine deutliche Abhängigkeit der Auswirkung vom Zeitpunkt der Behandlung. Erfolgte die Adalimumab-Behandlung vor oder gleichzeitig mit der TNFα-Stimulation der Endothelzellen, kam es zur Aufhebung der TNFα-induzierten Effekte sowohl in der Transkription der Adhäsionsmoleküle (PCR), der Expression dieser (Immunfluoreszenz-Mikroskopie) sowie der dynamischen Interaktionen mit Lymphozyten (Flusskammer). Eine dem TNFα nachfolgende Behandlung blieb ohne Wirkung, sodass davon auszugehen ist, dass sich die bereits induzierten Prozesse nicht mehr rückgängig machen lassen. Hier könnte eine Erklärung für das späte Eintreten der Adalimumab-Wirkung in vivo liegen.
Somit konnten in dieser Arbeit vier zentrale Ergebnisse erzielt werden:
Erstens, es wurde erstmals gezeigt, dass wichtige funktionelle Eigenschaften humaner Lymphozyten während der Kryokonservierung erhalten bleiben.
Zweitens, es wurden erstmals deutliche inter-individuelle Unterschiede im Ausmaß der Interaktion zwischen Lymphozyten ex vivo mit TNFα-stimulierten Endothelzellen nachgewiesen. Adalimumab unterdrückte diese dynamischen Interaktionen, sofern seine Zugabe vor oder gleichzeitig mit der TNF-Exposition erfolgte.
Drittens, diese inter-individuellen Unterschiede bestanden gleichermaßen bei gesunden Probanden und Psoriasis-Patienten.
Viertens, die funktionellen Unterschiede erlaubten keine Unterscheidung zwischen Psoriasis-Patienten, deren Erkrankung sich durch Adalimumab besserte („Responder“), und denen, deren Erkrankung nicht auf diese Therapie ansprach („Non-Responder“).
Schlagwörter: Psoriasis; TNF-Antagonisten; Endothelzellen; Leukozyten