Der Einfluss des Transkriptionsfaktors Runx2 auf osteogene und adipogene Differenzierungsmarker, insbesondere auf PPARγ
The influence of the transcription factor Runx2 on osteogenic and adipogenic differentiation markers, particularly on PPARγ
by Jana Daniela Deuschl
Date of Examination:2013-12-11
Date of issue:2014-01-07
Advisor:Prof. Dr. Heide Siggelkow
Referee:Prof. Dr. Heide Siggelkow
Referee:Prof. Dr. Nicolai Miosge
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Format:PDF
Abstract
English
Mesenchymal stem cells can differentiate into osteoblasts, adipocytes, chondrocytes or myoblasts depending on the predominant transcription factor. The influence of Runt-related transcription factor 2 (Runx2) increases osteoblast differentiation of mesenchymal stem cells, whereas the influence of Peroxisome proliferator-activated receptor γ (PPARγ) increases adipogenesis. The balance between these two factors and their interaction represents an important area in osteoporosis research. In this study, the role of Runx2 in pHOB cells, primary mesenchymal progenitor cells acquired from bone fragments, and SCP-1 cells, a human mesenchymal stem cell line expressing hTERT, was examined by siRNA knockdown and overexpression of Runx2. Moreover the interaction between Runx2 and PPARγ was investigated. Knockdown of Runx2 was achieved by RNA interference (siRunx2), whereas Runx2 overexpression was induced by using a Runx2-expressing plasmid. PPARg and Runx2 gene expression was analyzed by real-time PCR and protein synthesis by western blot analysis. The functional influence of Runx2 overexpression on PPARg transcription was investigated by cotransfection of the PPARg promoter-luc. PPARg functional protein activity was investigated by transfection of the PPARg responsive element (PPRE-luc). Activity of PPARg promoter and functionality of proteins were analyzed by luciferase assay. This study showed that pHOB cells differentiate at basal culture conditions along the osteogenic pathway. Two consecutive transfections of siRunx2 sufficiently suppress Runx2 mRNA to about 10.1% over 29 days. This was followed by an increase of PPARγ mRNA after 7 days and by the suppression of the osteogenic differentiation factors OC und AP. No rescue of Runx2 gene expression by osteogenic stimulation could be observed. To examine the interaction of Runx2 and PPARγ, SCP-1 cells were treated with adipogenic stimulation medium, which increased PPARγ2 mRNA, PPARγ promoter activity and the functionality of PPARγ protein. Costimulation with troglitazone induced PPARγ2 mRNA expression. Runx2 inhibited PPARγ on the level of the promoter activity in SCP-1 cells, therefore at the level of mRNA synthesis. This study shows for the first time that the influence of Runx2 on the interaction between osteogenesis and adipogenesis is an effect on PPARg transcription at the promoter.
Keywords: Runx2; PPARγ; adipogenesis; osteogenesis; mesenchymal stem cell
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Mesenchymale Stammzellen können sich durch den Einfluss verschiedener Transkriptionsfaktor zu Osteoblasten, Adipozyten, Chondrozyten oder Myoblasten differenzieren. Während sie sich unter Runx2-Einfluss entlang der osteoblastären Linie differenzieren, entwickeln sie sich bei vorliegendem PPARγ entlang des adipogenen Differenzierungswegs. Das Gleichgewicht zwischen beiden Faktoren und ihr Zusammenspiel stellen einen wichtigen Bereich in der Osteoporoseforschung dar. In dieser Dissertation wurde durch Runx2-Suppression bzw. Runx2-Überexpression die Rolle dieses Faktors in pHOB und SCP1-Zellen erfasst und die Interaktion zwischen Runx2 und PPARγ untersucht.
Der Runx2-Knockdown’ erfolgte mittels RNA-Interferenz, die Runx2-Überexpression durch ein Runx2 exprimierendes Plasmid. In RT-PCRs wurden mRNA-Messungen durchgeführt. Die Proteinbestimmung erfolgte im ‚Westernblot’. Der funktionelle Einfluss der Runx2-Überexpression auf die PPARγ-Transkription wurde durch Kotransfektion des an Luziferase gekoppelten PPARg-Promotorgens erfasst. Die funktionelle Aktivität des PPARg-Proteins wurde durch die Transfektion des an Luziferase gekoppelten PPRE-Gens gemessen. Promotoraktivität und Funktionalität der Proteine wurden in Luziferase-Reportergenassays erfasst.
Unter basalen Kulturbedingungen differenzierten sich pHOB osteogen. Durch zweimalige siRunx2-Transfektion gelang auf mRNA-Ebene eine suffiziente Runx2-Suppression über 29 Tage auf durchschnittlich 10,1%. Neben einer Steigerung der PPARγ-mRNA nach sieben Tagen konnte darunter auch eine Suppression der osteogenen Differenzierungsmarker OC und AP beobachtet werden. Ein ‚Rescue’ der supprimierten Runx2-Genexpression konnte durch osteogene Stimulation nicht erreicht werden.
In den Runx2-/PPARγ-Interaktionsversuchen wurden SCP1-Zellen adipogen stimuliert, um die PPARγ2-mRNA und PPARγ-Promotoraktivität zu erhöhen. Darunter konnte ebenfalls eine gesteigerte Funktionalität des PPARγ-Proteins beobachtet werden. Durch Runx2-Überexpression wurde in SCP1-Zellen die PPARγ-Promotoraktivität und somit der Beginn der mRNA-Synthese gehemmt. Die PPARγ2-mRNA hingegen blieb unbeeinflusst.
Die zentrale Rolle des Runx2 in der osteogenen Differenzierung scheint durch den Einfluss auf die osteogenen Marker OC und AP in pHOB bestätigt zu werden. Auch der Einfluss auf die adipogene Differenzierung erfolgt über Runx2. Im Rahmen dieser Dissertation konnte erstmalig die Hemmung des PPARγ-Promotors durch Runx2 beschrieben werden. Hierdurch werden die PPARγ-Transkription und somit voraussichtlich die Interaktion zwischen Adipogenese und Osteogenese beeinflusst.
Schlagwörter: Runx2; PPARγ; Osteogenese; Adipogenese; Mesenchymale Stammzelle