| dc.contributor.advisor | Winkler, Michael PD Dr. | |
| dc.contributor.author | Reinke, Lennart Michel | |
| dc.date.accessioned | 2017-04-24T08:31:34Z | |
| dc.date.available | 2017-05-11T22:50:06Z | |
| dc.date.issued | 2017-04-24 | |
| dc.identifier.uri | http://hdl.handle.net/11858/00-1735-0000-0023-3E1F-D | |
| dc.identifier.uri | http://dx.doi.org/10.53846/goediss-6266 | |
| dc.language.iso | deu | de |
| dc.rights.uri | http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/ | |
| dc.subject.ddc | 610 | de |
| dc.title | Identifikation und funktionelle Charakterisierung von TMPRSS2-Spaltstellen im Spike-Protein des SARS-Coronavirus | de |
| dc.type | doctoralThesis | de |
| dc.title.translated | Identification and functional characterization of TMPRSS2-cleavage sites in the spike protein of SARS-Coronavirus | de |
| dc.contributor.referee | Walter, Lutz Prof. Dr. | |
| dc.date.examination | 2017-05-04 | |
| dc.description.abstractger | Das severe acute respiratory syndrome-Coronavirus (SARS-CoV) ist ein neu aufgetretenes Pathogen, das eine erhebliche Gefahr für die menschliche Gesundheit darstellt. Das virale Oberflächenprotein spike (SARS-S) vermittelt die Bindung und den Eintritt des Virus in Wirtszellen. Die Aktivierung des S-Proteins durch Wirtszellproteasen ist essentiell für dessen Funktion. Vorangegangene Arbeiten zeigten, dass Trypsin und die zelluläre Protease TMPRSS2 das S-Protein durch Spaltung aktivieren. Die Spaltstelle für Trypsin, R667, ist bekannt. Spaltstellen der TMPRSS2 hingegen sind noch nicht gefunden. Sie scheinen sich jedoch von der Trypsin-Spaltstelle zu unterscheiden, da Trypsin und TMPRSS2 Spaltfragmente von unterschiedlichem Molekulargewicht erzeugen. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die TMPRSS2-Spaltstelle(n) im SARS-CoV S-Protein zu identifizieren und ihre Bedeutung für die proteolytische Aktivierung des S-Proteins zu charakterisieren.
Für die Identifizierung der TMPRSS2-Spaltstellen in SARS-S wurden Aminosäuren mutiert, für die auf der Basis von vorangegangenen Arbeiten und von Sequenzanalysen eine Rolle in der S-Protein-Spaltung vermutet wurde. Anschließend wurden die SARS-S-Expression, zelluläre Lokalisation, Spaltung und der S-Protein-getriebene Wirtszelleintritt untersucht. Für die Herstellung der Mutanten wurde PCR-basierte Mutagenese eingesetzt. Zum Nachweis der Expression wurden die Mutanten mit einem V5-antigenen tag ausgestattet. Die Mutation der Aminosäuren K543/R544 oder R563/K566 verhinderte die Prozessierung des S-Proteins durch Trypsin, die Mutationen R563/K566 unterdrückte zusätzlich die Spaltung durch TMPRSS2. Dieser Effekt war jedoch mit hoher Wahrscheinlichkeit auf eine veränderte zelluläre Lokalisation dieser SARS-S-Mutanten zurückzuführen. Es konnte bestätigt werden, dass die Aminosäure R667 für die Spaltung des S-Proteins durch Trypsin wichtig ist und dass Trypsin und TMPRSS2 unterschiedliche Spaltfragmente erzeugen (100 kDa versus 85 kDa). Die Unterschiede im Molekulargewicht der Fragmente konnten jedoch durch Behandlung mit dem Enzym PNGase F auf ein unterschiedliches Glykosylierungsmuster zurückgeführt werden. Obwohl R667 für die SARS-S-Spaltung durch Trypsin und TMPRSS2 essentiell war, konnte kein klarer Beitrag dieser Aminosäure zur S-Protein-Aktivierung durch diese Proteasen gezeigt werden. Die umgekehrte Beobachtung wurde für R797 gemacht, einen Aminosäurerest, für den publizierte Arbeiten ebenfalls eine Rolle in der S-Protein-Aktivierung durch Trypsin postulieren. R797 war für die S-Protein-Aktivierung durch Trypsin und TMPRSS2 essentiell, jedoch für die Spaltung durch diese Proteasen verzichtbar. Diese Ergebnisse zeigen, dass R667 für die SARS-S-Spaltung durch TMPRSS2 und Trypsin wichtig ist. Sie zeigen aber auch, dass die Aktivierung des S-Proteins durch proteolytische Spaltung komplexer ist als ursprünglich angenommen. | de |
| dc.description.abstracteng | The severe acute respiratory syndrome coronavirus (SARS-CoV) is an emerging pathogen, which poses a substantial threat to human health. The viral surface protein spike (SARS-S) mediates viral entry into target cells. The activation of the S-protein by host cell proteases is essential for its function. Previous studies have shown that trypsin and the cellular protease TMPRSS2 activate SARS-S by cleavage. The cleavage site for trypsin, R667, has been identified while the cleavage site for TMPRSS2 is unknown. However, the observation that trypsin and TMPRSS2 produce SARS-S fragments of different size suggests that these proteases cleave SARS-S at different sites. The aim of this study was the identification of the TMPRSS2 cleavage site(s) within SARS-S and the characterization of their role in the proteolytic activation of the S protein.
For the identification of TMPRSS2 cleavage sites amino acids were mutated, which presumably play a role in S-protein-cleavage, based on sequence analysis and previous studies. Subsequently, SARS-S expression, cellular localization, cleavage and S-protein mediated cellular entry were investigated. The mutants were produced by PCR-based mutagenesis. For detection of expression, the mutants were equipped with a V5-antigenic tag. Mutation of amino acids K543/R544 or R563/K566 abrogated SARS-S processing by trypsin and, in case of K563/K566, TMPRSS2. However, this effect was most likely due to an altered cellular localization of these mutants. It could be confirmed that R667 is important for SARS-S processing by trypsin and that S protein cleavage by trypsin and TMPRSS2 generates different fragments (100 kDa versus 85 kDa). This difference in molecular weight was due to differential glycosylation of the cleavage fragments, as demonstrated by PNGase F digest. Although R667 was essential for cleavage by trypsin and TMPRSS2, this amino acid was dispensable for SARS-S activation. The opposite effect was detected for R797, an amino acid residue, which has been described to play an important role in SARS-S activation by trypsin. R797 was essential for S protein activation by trypsin and TMPRSS2 but was dispensable for cleavage by these proteases. The results of the present work show that R667 is important for the SARS-S cleavage by TMPRSS2 and trypsin. However, they also indicate that the activation of the S protein by proteolytic cleavage is more complex than assumed. | de |
| dc.contributor.coReferee | Lüder, Carsten Prof. Dr. | |
| dc.contributor.thirdReferee | Meyer, Thomas Prof. Dr. | |
| dc.subject.ger | SARS-Coronavirus, spike, TMPRSS2 | de |
| dc.subject.eng | SARS-coronavirus, spike, TMPRSS2 | de |
| dc.identifier.urn | urn:nbn:de:gbv:7-11858/00-1735-0000-0023-3E1F-D-8 | |
| dc.affiliation.institute | Medizinische Fakultät | de |
| dc.subject.gokfull | GOK-MEDIZIN | de |
| dc.description.embargoed | 2017-05-11 | |
| dc.identifier.ppn | 884843726 | |