Investigating chemical crosslinking of protein-RNA complexes by mass spectrometry

Wulf, Alexander

dc.contributor.advisor	Urlaub, Henning Prof. Dr.
dc.contributor.author	Wulf, Alexander
dc.date.accessioned	2022-08-12T07:58:34Z
dc.date.available	2022-11-21T00:50:08Z
dc.date.issued	2022-08-12
dc.identifier.uri	http://resolver.sub.uni-goettingen.de/purl?ediss-11858/14209
dc.identifier.uri	http://dx.doi.org/10.53846/goediss-9406
dc.language.iso	eng	de
dc.rights.uri	http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/
dc.subject.ddc	570	de
dc.title	Investigating chemical crosslinking of protein-RNA complexes by mass spectrometry	de
dc.type	doctoralThesis	de
dc.contributor.referee	Urlaub, Henning Prof. Dr.
dc.date.examination	2021-11-22	de
dc.description.abstracteng	RNA plays a quintessential role in cellular processes such as gene expression, transcription, RNA processing, and translation. Proteins carrying out those diverse functions are inherently flexible to accommodate dynamic RNA structures, leading to a structurally adjustable RNA-binding protein (RBP) complex that often evades crystallographic or cryo-EM analyses. To elucidate protein-RNA interfaces of such RBPs, crosslinking coupled with mass spectrometry (XL-MS) can provide direct evidence of interacting amino acid residues and nucleotides. XL-MS captures transient interactions that are stabilized through the crosslinking event, and enable peptide-centric analyses that also shed light on the crosslinked nucleotide. Here, a chemical crosslinking workflow for the chemical crosslinkers 1,2,3,4-diepoxybutane (DEB), nitrogen mustard (NM), and 2-iminothiolane (2-IT) is presented that allows for specific, reliable, and unambiguous identification of protein-RNA interfaces at amino acid resolution. The workflow consists of 6 steps: chemical crosslinking, RNA and protein digestion, C18 chromatography, TiO2 enrichment, ESI-LC-MS/MS, and data analysis using the RNPxl/Nuxl software. Acquired data from chemical crosslinking coupled with mass spectrometry (cXL-MS) of model protein Hsh49 with various synthetic RNAs features detectable nucleic acid fragments to all four nucleotides. Moreover, insights from this cXL-MS data demonstrate that certain crosslinkers display a nucleotide preference and that cXL-MS generally identifies complementary cross-link sites to canonical UV-crosslinking. Here, lists of mass shifts that are specific to each nucleotide and crosslinker combination are reported, allowing spectral annotation to identify crosslinked spectrum matches (CSMs) by the RNPl/Nuxl software. The Hsh49 model system is expanded by its cognate protein Cus1 and U2 RNA, forming a part of the yeast spliceosomal complex, and analyzed by cXL-MS, revealing RNA-binding activity in both RNA recognition motifs. Additionally, methyltransferase Dnmt2 and the negative elongation factor complex (NELF) are analyzed by the developed method. This revealed previously unknown alternative confirmations of Dnmt2 and substantial RNA-binding events within the tentacle regions of the NELF complex, adding valuable information on the protein-RNA interplay in these complexes. When expanding cXL-MS of protein-RNA complexes to live cells, multiple RBPs from E. coli, B. subtilis, and human HeLa cells were identified in states bound to their cognate RNAs in vivo, which illustrates the powerful application of this method to complex samples.	de
dc.contributor.coReferee	Bohnsack, Markus Prof. Dr.
dc.contributor.thirdReferee	Cramer, Patrick Prof. Dr.
dc.subject.eng	Crosslinking mass spectrometry	de
dc.subject.eng	protein-RNA complex	de
dc.subject.eng	Ion mobility mass spectrometry	de
dc.subject.eng	Methode development	de
dc.subject.eng	E. coli	de
dc.identifier.urn	urn:nbn:de:gbv:7-ediss-14209-2
dc.affiliation.institute	Biologische Fakultät für Biologie und Psychologie	de
dc.subject.gokfull	Biologie (PPN619462639)	de
dc.description.embargoed	2022-11-21	de
dc.identifier.ppn	1814287256
dc.notes.confirmationsent	Confirmation sent 2022-08-12T08:15:01	de

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Format:Unbekannt

Beschreibung:Appendix CD XXXII

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Name:SessionB_UV_RNA_HFX_S100.pdf

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Beschreibung:Appendix CD XXXIII

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Name:SessionB_UV_RNA_HFX_S100.Rmd

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Format:Unbekannt

Beschreibung:Appendix CD XXXIV

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Name:XL_positions_Hsh49_Cus1_U2s.xlsx

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Beschreibung:Appendix CD XXXV

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Fakultät für Biologie und Psychologie (inkl. GAUSS) [1621]

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